造血干细胞研究发展历史引发的思考
中国实验血液学杂志 Jou rna l o f Exper i m enta l H e m a t o l o gy 2005; 13(5):723-732
文章编号(A rticle I D ):1009-2137(2005) 05-0723-10
723
专论
造血干细胞研究发展历史引发的思考
唐佩弦
(本刊主编)
摘要 本文简要地回顾了世界干细胞研究数十年的历史经过。它的原始研究是为了解决二次大战末在日本两
次核爆炸中所见的致死性造血损伤, 这也说明世界干细胞研究为什么从造血干细胞开始, 而且人们长期不关心非造血干细胞在体内是否存在。20世纪50-60年代一些聪明设计的动物实验有力地暗示造血干细胞在体内的存在, 动物研究又证实正常骨髓可以修复已严重破坏的骨髓, 于是人们开始相信骨髓移植就是造血干细胞移植。培养造血祖细胞集落的陆续发现证明造血祖细胞的存在。直至上世纪90年代, 有了N OD SC I D 或羊胎等体内检测造血干细胞的可靠方法之后, 才划清了造血干细胞和祖细胞的界限。本文列举了许多实例, 说明实验血液学和临床血液学发展的互动性, 以及其它生物学和技术的进步, 尤其是免疫学和分子生物学的进步, 极大地推动了干细胞基础研究和临床干细胞移植的发展。比如HLA 、单克隆抗体、D NA 分子克隆、基因重组工程技术以及近年发展的生物信息学、基因组学、蛋白质组学、干涉RNA 、干细胞工程技术等, 使干细胞基础和临床研究进入了21世纪的新时代。免疫治疗、间充质干细胞和干细胞工程的发展, 结合用于造血干细胞移植, 使细胞治疗多元化成为本世纪发展的新动向。本文着重地介绍了干细胞研究的每一步发展都同时出现认识上的误区, 以及给干细胞研究带来了挫折。一个误区的澄清常常历时20甚至40多年之久。例如造血干细胞与祖细胞的区分; 造血干细胞体外扩增研究在世界各国注定的失败; 移植脐血缺乏的是造血干细胞, 还是祖细胞; 多数白血病是否起病于造血干细胞; 以造血干细胞是否是基因治疗中最佳的外源基因载体; 又如干细胞工程能否克隆实质脏器等等。在成体组织内存在成体干细胞是21世纪划时代的伟大发现, 却也带来了误区和风波。本文重点分析了在成体干细胞发现的同时为什么会出现横向分化、去分化等缺乏科学根据的假说, 以及部分同行视线混乱的根源与教训。文章指出误区的发生是由于缺乏实践和认识的片面性造成的, 科学实践是检验和纠正认识片面性的唯一途径。整个干细胞研究的发展历史正是一个不断纠正认识误区的过程, 也是必由之路。
关键词 干细胞; 造血干细胞; 造血祖细胞; 成体干细胞; 胚胎干细胞; 干细胞生物学中图分类号 R 331. 14; R 331. 2; R322. 2文献标识码 A
Adjunctive R eflections on H istory of H e matopoietic Ste m C ell Study Ed itoria l
TANG P ei X i a n
Ed itor i n Ch ief , Jou m a l o f Experi m en t a lH erato l ogy, Beiji n g 100850, C h i na
Abstract T he a rti c l e rev i ew s conc ise l y around t he history o f hem a t o po i e tic stem cell research , basi c and c linica, l si nce its v ery beg inn i ng after the nuc l ear explo si ons a t t he end o f the Second W o rldW a r , tha t ex plains w hy the ste m cell study in the w or l d beg an w ith the he m atopo ieti c stem ce lls and t he ex istence o f no n he m atopo ieti c st em ce ll i n v ivo had been left out o f acco unt fo r m any decades till 21st century . D uri ng 50-60s o f t he last century, it w a s know n from the an i m a l ex per i m ents tha t there m ust be he m a topo i e tic ste m cells ex isti ng i n vivo and be liev ed t hat t he effecti v e bone m a r row transplan t is actua lly the stem ce ll transp l antati on . It is rev iew ed how t he basic studies of stem ce ll i nteracted w ith t he c linical ste m ce ll trans p l anta tion and how g rea t the con tributi on w as g iven to strong l y push fo r w ard t he dev e l op m en t o f conte m po ra ry ste m cell bio l o gy and m odern he m ato logy from the ba sic st udies espec iall y in t he i m m uno l o g ical and m o l ecular b i o l og i ca l f i e l ds , for i n stance , the appli ca tions o f HLA techno logy and m o no clonal anti body produced , fl ow cy tom e try, and g enetic recom b i nan t cy t ok i nes , t he nov e l technique fo r gene c l o ni ng, g enom ics , pro t eom ics , and i RN A a s w e ll a s bi o i nfo r m atics . I t has l ead t o the plura listi c ce ll t herapy a s a no ve l trend i n ste m ce ll tran s p l antation a s to com b i ne i m m uno therapy and m esenchym a l stem cells w it h t he co nv entiona l stem ce ll trans p lants . T his pape r l oo ks back in t he past severa l decades , how ever , on eve ry achieve m en t o f ste m ce ll st udy t ha t w e re us ua lly accom pan ied w it h som e idea listic one si dedness o r even erro rs i n de si gn and conc l usion o f som e ex per i m ents . U sua lly it t o ok a per i od o f 2o r e v en 4decades t o clar i fy s om e basic i dea , that see m ed no r m a l i n the science deve l opm en , t for exa m p les , t he d i v idi ng li ne
通讯作者:唐佩弦, 研究员, 军事医学科学院基础医学研究所, 北京太平路27号, 邮编100850. 电话:(010) 66930551. 传真:(010) 68215932. E m a i :l pxtang @yahoo . com -; 07-
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bet w een the he m atopo ieti c stem ce ll and prog en ito r ce lls , po ssibility to expand o r c l one the real ste m ce ll ex v ivo, and
w he t her the m ajor ity o f l euke m i a s are or i g i nated from ste m ce ll l eve , l etc . T ow ards the end o f 20th century , the g rea test d isco very w as t he ex istence o f adult ste m ce lls i n adu lt tissue s , w h i ch are no doub t t he re m nan ts from t he e m bry on i c de v elop m ent inc ludi ng a ll stag es o f em bry onic ste m ce lls , very ear lier and later , he m atopo i e ti c and nonhe m atopo ieti c , and co ul d be i nduced to d i fferen tiate i nto a ll k i nds o f tissue cells by proper w ays i n v itro . N o ev i dence has reall y pro v ided fo r t he hy po the sis o f s o ca lled trans differentiati on o r de differenti a ti on , w h ich brought abo ut strong calls i n que sti o ns i n the past 5y ea rs . T he prob le m s in dev e l op i ng the c linical gene t herapy by usi ng he m atopo i e ti c ste m ce ll as carrier o f i n tere st ed gene still re m a i ned to be so lved s o far . B ecause of the re lati v ely w eak base o f related basic stud i es , the c linical appli ca tion o f g ene t herapy re sulted i n t he fa ilure o f cli n i ca l practi ce w ith lo ts o f less o ns tow ards t he end o f l a st cen tury . T he w ho le hist o ry o f ste m cell study in the w o rld w as an endless pro ce ss o f con ti nuo us redre ss fo r t heo re ti ca l i deas i n ste m ce ll bio logy t hat had nev er been con s u mm ate . K ey w ords ste m ce l; l hem atopo ietic ste m ce l; l he m a topo i e tic prog en itor cel; l adult ste m ce l; l e m bryon i c ste m ce l; l stem ce ll bio l o gy
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干细胞的原始研究是怎样启动的, 为
什么从造血干细胞开始?
造血干细胞(he m atopo i e tic ste m cell) 在19世纪仅仅是生理学家们的一个抽象的推理, 却一直没有证明它存在的直接证据, 临床医学也不知有什么造血干细胞缺陷的疾病, 更没有利用造血干细胞进行治疗疾病的理念。1945年日本广岛、长崎两颗原子弹爆炸, 不计其数的人受到致死剂量的电离辐射后因造血严重衰竭而惨死, 无一生还。于是, 发达国家出现了辐射生物学和辐射损伤治疗的研究。1951美
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国B rookhaven 国家实验室B recher 和C ronk ite 等的联体大鼠(parabio sis) 和肢体屏敝照射等聪明设计的实验给了极重要的启示:即未经照射的正常骨髓可以治疗致死量辐射所致的骨髓严重衰竭。不
[2]
久, 美国Lo renz 等第一个报道骨髓细胞悬液输注受致死照射动物的实验结果, 发现正常同种系动物供者的骨髓可以在严重破坏的受者骨髓中重新建立造血组织, 并提出! 移植∀的科学假设, 从此出现了! 骨髓移植∀(bone m arrow transp l a ntation , B M T) 的术语。但是, 这一切都还仅仅是动物实验的结果。1958年以后, 世界各地和中国陆续出现大剂量意外辐射核事故的病人, 都用了未经组织配型的异体骨髓输注, 没有1例获得移植治疗成功的。当时人们对人类移植免疫学一无所知, 面对失败而困惑不解。
20世纪60年代美国C ronk ite 首创地用细胞放射自显影技术, 对造血细胞的增殖分化的动力过程做了大量深入的动物研究, 获得了丰富的实验数据, 有力地暗示体内造血干细胞! 库∀的存在。1961年
[3]
加拿大T ill 和M c C ulloch 第一次报道发现CF U S , 作者和人们都朦胧地把CFU S 误当作小鼠造血Pluzn 和澳大利亚M e tca lf 分别发现人CF U C (即CF U i n culture 的缩写, 后正式改称CF U GM ) 。当时人们对造血祖细胞的无知, 把粒单系祖细胞CF U GM 当作造血干细胞, 并错误地把祖细胞集落检测称之为! 干细胞培养∀。又完全错误地把有多向分化潜能和高度增殖力等造血祖细胞的两大特征作为造血干细胞的定义。
1970年S tephenson 首次发现红系晚期祖细胞集落CF U E 。1979年加拿大Fauser , M essner 和美国O gaw a 等又先后报道发现了小鼠和人类CFU GE MM, 他们当时都误认为这类含有多向髓系分化潜能的早期髓系祖细胞是多向分化潜能的造血干细胞, 作者们都忽略了CFU GE MM 和CFU S 的集落中都不含淋巴系细胞集落的重要事实。更不知早期祖细胞也是多向性的。到20世纪70年代, 深入的基础研究开始证实造血祖细胞的存在, 并推论骨髓移植重建造血的成功是因为植入了正常的造血干细胞。于是! 骨髓移植是造血干细胞移植∀的理念开始被广泛公认。
[5]
1974年Friedenstein 等关于CFU f 的报道, 犹如瞎子摸象, 作者们仅仅凭初级形态学把骨髓贴壁培养的貌似成纤维细胞的集落, 一概视为CFU f 。但这正是同一实验室以后进行间充质细胞的起点。
[6]
1978年Scho fi e l d 等提出了造血干细胞微环境和! 壁龛(n iche) ∀假说, 人们开始假设骨髓基质(stro m a) 所构成的微环境是正常造血必要的条件。但由于对骨髓基质的构成及其对微环境中细胞 细胞相互关系和细胞因子造血调控的机制等茫无所知, 在体外培养中更无法模拟体内的造血微环境, 使造血微环境的研究长期停滞不前约30多年之久。
以上说明为什么世界上最早干细胞研究的历史是从造血干细胞开始的, 而且说明为什么50多年来直至[4]
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胞之外还有各类非造血组织的干细胞的存在, 以及关心它们在临床广泛应用的美好前景。
现代免疫学和分子生物学的发展对造血干细胞和现代血液学研究的巨大推动
人类白细胞抗原的发现
20世纪60年代法国巴黎圣路易医院实验室一名普通年轻人Jean D ausset 在分析比较肾移植成功和失败的原由时, 偶尔发现供者血液中白细胞表面的一种抗原, 在移植失败的病人血清中又有相应的抗体, 可破坏移植肾的活存。最初命名为! 人类白细胞抗原(H u m an Leuko cy te A ntigen , HLA ) ∀, 在各国免疫学家们不懈努力研究下, 一步一步地扩展这个伟大的发现, 证明白细胞抗原(HLA ) 也是体内各种组织细胞的共同的组织抗原, HLA 的各个亚型位点、基因定位和随后陆续发现上千个等位基因等, 终于逐步打开了移植免疫学的大门。1984-1985年HLA 理论和技术的丰硕成果先后3次荣获诺贝尔医学生理学奖; HLA 技术极大地推动干细胞异基因移植。美国华盛顿大学Fred H utch i n son 医院Thom as 和
[7-9]
Sto rb , B uckner 等几名普通血液病医生在世界上率先利用HLA 技术, 用HLA 相合孪生同胞供者同基因骨髓移植治疗白血病第1例成功的报告, 震惊了全世界; 随着HLA 抗原各亚型和检测技术的建立, 各亚型标准血清相继研制成功。D ona l d Tho
[9]
m as , 一个名不见经传的血液科医生, 不怕屡屡的失败, 坚持不懈努力, 并率先应用刚诞生的HLA 血清学配型技术, 创造性地进行了HLA 相合孪生和非孪生同胞供者骨髓移植治疗白血病。他在20世纪70年代不间断的移植后随访中, 发现造血干细胞移植后部分白血病病人长年不复发并恢复正常生活, 在世界上第一次揭示了恶性疾病被根治的可能和事实。临床的成就更鼓舞基础研究的发展。
单克隆抗体制备技术的伟大发明
1975年M ilstein 和K ohler 发明单克隆抗体技术。这个伟大的免疫学发明给血液学的发展带来了新的生命。血液病的诊断和治疗等研究加速发展, 白血病开始了免疫分型, 大大提高了诊断水平。1984单克隆抗体技术的伟大发明也获诺贝尔医学生理学奖。从此, 单克隆抗体产品开始用于血液学基础研究和临床的免疫诊断。接着, 流式细胞术创造的、用量分析技术也应运问世了。流式细胞术有力地推动
细胞增殖动力学、肿瘤细胞生物学、血液学的基础研究和临床的发展。但由于单克隆抗体人源化研究的艰难, 经过了很多年的努力才开始用鼠/人嵌合性单克隆抗体作为人源化的第一步, 单克隆抗体用于临床血液肿瘤的靶向免疫治疗终于成为可能。移植物T 细胞对宿主排斥效应、T 细胞亚群和功能的多样性、GVH 和GVL 的可分性的发现
[10]
1985年M arti n 等证实GVHD 的发生与移植物中T 效应细胞有关, 于是迅速开展应用抗T 细胞单抗体外清除(purg i n g) 骨髓T 细胞技术, 进行去T 细胞骨髓移植(T cell depleted B M T, TDB M T ) 的尝试。不料临床结果表明TDBM T 明显降低了临床植入率。此后免疫 血液学家们执著20年不断的研究, 发现T 细胞亚群和功能的多元性, 原来启动GVHD 的是移植物T 细胞的一个亚群, 而T 细胞其它某亚群却是抑制GVHD 的; 还有的T 细胞亚群是移植物中支持植入的必不可少的。既而又发现移植物中T 细胞还有另一些亚群和NK 细胞协同, 可以有效地长期监视和抑制宿主体内治疗后残存的少量恶性细胞的复苏, 诱导特异性的CTL 杀伤效应, 即GVL 效应。T 细胞亚群和功能的多样性的发现是21世纪当前免疫学对造血干细胞研究的新的重要贡献, 它指明了临床GVHD 和GVL (GVT ) 二者的既有相关性, 又有可分性, 和今后同时实现低GVHD /高GVL 的可能性。
分子生物学发展造就了现代分子血液学1985-1986年澳大利亚GM C SF /G C SF 的发现者
[4]
D ona l d M e tca lf 和美国华裔分子生物学家杨育中(YC Y ang ) 相继分子克隆成功GM C SF 、G C SF, 及I L 3、I L 6和I L 11c DNA, 分子生物学理论和技术伴随具有造血/免疫调控功能的细胞因子一起切入血液学领域。从此打开了本来一无所知的细胞因子的领域, 新的核酸技术解决了原来根本无法检测分
-12
析组织中含量在10m o l/L以下的细胞因子和细胞内和组织内的定性和定量分析, 又解决了细胞因子的基因定位和基因结构等。基因工程技术又可以大量制备了人类重组细胞因子, 用于临床和实验研究。此时, 一个核酸化学实验室的普通年青人M ul lis , 发明了PCR 技术, 极大地促进分子生物学的发展, 并在1993年荣获诺贝尔化学奖。同一时代又蜂拥出现了新兴的基础学科生物信息学(b i o i n fo r m at ics), 基因组学、蛋白质组学, 以及基因芯片, 和干涉
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子 细胞 临床相结合崭新的时代, 一个欣欣向荣的
近代血液学时代。
干细胞基础研究的发展和临床干细胞移植发展的互动
我国干细胞学科整体发展的起步
20世纪60年代我国只有个别科研单位从事造血干细胞的实验研究。在文革后百废待兴的岁月中, 我国部分实验和临床血液学家们艰辛地开始恢复了科学探索, 1979年我国首例HLA 相合异基因亲缘骨髓移植成功(陆道培等) 。1983-1984年我国第一次全国造血祖细胞和集落培养学习班和首次全国干细胞学术会议, 推广了造血干祖细胞的基础研究和临床检测, 造就了我国第一批造血干细胞基础和临床研究的骨干。我国出现首批实验血液学的专业队伍, 中国实验血液学会成立, 90年代初又创建了国家级科技核心期刊#中国实验血液学杂志∃(Jour nal of Experi m enta lH e m ato l o g y), 为我国基础血液学的整体发展奠定了基础。由于长期不开放和! 文革∀的影响, 我国干细胞研究在全国整体发展的起步比国际落后约20多年。
国际造血干细胞临床和基础研究的齐头并进1992年Thom as 骨髓移植治疗白血病获得诺贝尔首次临床医学奖, 这是世界上第一个临床医学项目获此殊荣, 极大地振奋了医学界, 特别是血液学界。基础研究的成果有力地推动临床发展。临床的发展又向基础研究提出了无数重要课题。
[11]
1988年Socinski 等发现G C SF 动员造血干祖细胞从骨髓大量转移到循环血的作用, 经动员的
[12]
外周血成为干细胞新供源; 1994年B ensi n g er 等报告第一例外周血造血干细胞移植; 仅2年后(1996年) 我国首例外周血造血干细胞也报道移植成功
[13]
(陆道培等) , 表明我国血液学临床科技发展正加快和国际同步。1998年由于HLA 技术的发展和引进, 我国首例非亲缘异基因骨髓移植也相继成功(陆道培等) 。非亲缘异基因骨髓移植虽然难度和风险较大, 但反映了生物技术发展的高水平。它扩大了造血干细胞供源, 又有使恶性病复发率长期降低的效果。对积累了丰富治疗经验的、设备优越又掌握HLA 高分辨检测技术的标准层流移植病房中, 非亲缘异基因移植(骨髓、动员外周血或脐血移植) 已经是现代造血干细胞临床移植发展的主流方向。, DNA 合的供者, 进行单倍体相合的亲缘性异基因骨髓移植, 结合非清髓预处理和强化免疫抑制等, 可以收到较好的治疗效果, 其最大的优点是基本保证了供源。但长期的强化免疫抑制是否会抑制GVL 而增加恶性病的复发, 正是一个值得探讨的课题。
CD 34抗原的发现, 进一步澄清造血干细胞和祖细胞的特征和区分
1984年C iv in 第一个发现在正常骨髓及白血病细胞
[14]
表面有一种抗原, 当时取名为M y 10, 因为当时国际上还没有CD 命名系列。1994年美国K rause 等首次报告, CD 34是造干/祖细胞的表面标志, 其实, CD 34抗原就是当年C iv in 发现的M y 10抗原。所以, CD 34首先发现人应该是C iv i n 。CD 34是一种分化抗原, 启动了造血干祖细胞的检测、富集的研究。以后基础研究进一步发现了用先天性重度免疫缺损小鼠(SC I D, NOD SC I D ) 或羊胎内等体内检测造血干细胞的方法。也从理论上完善了对造血干细胞的认识, 明确了造血干细胞和造血祖细胞的区分界限。国际上开始公认具有兼向髓和淋巴两大系分化潜能的才是造血干细胞, 而造血祖细胞已经失去髓/淋巴两系兼向分化的潜能。造血祖细胞只限于单独定向髓系或淋巴系分化。国际又公认:造血干细胞在移植后可以长期或永久重建造血, 临床移植后在病人血液里的供者血细胞理论上也应该是永久存在的, 所以至少观察1年以上, 才可判断干细胞移植究竟是否成功。然而, 造血祖细胞植入后的重建造血只能短期的, 数周或数月后病人体内的供者血细胞全部消失。那些只包含髓系, 或只包含淋巴系的各种C F U 集落的体外检测, 如CFU H PP , LTC I C, CFU S, CFU GE MM , BFU E , CFU GM, CFU E 等都是检测各种早期/晚期造血祖细胞的, 它们都不能准确反映临床造血干细胞移植的长期效果。经过40多年漫长的探索, 造血干细胞和祖细胞的区分界限终于得到澄清。但直至今日, 国内外部分同行对干祖细胞的界限仍然混淆不清。例如, 有的作者把造血干细胞直接分化而来的髓系及淋巴系祖细胞, 误称为! 髓系干细胞∀及! 淋巴系干细胞∀等。
-1996年CD 34细胞的发现, 但出现片面否定+
CD34细胞的思潮; 其实, 造血干细胞表达CD 34分化抗原也是在中胚层干细胞向造血干细胞分化的基
+
因! 决定∀(deter m inati o n) 之后才表达的, CD 34细
-胞的前体必然是CD34, 不是什么惊人的发现。但CD +
[15]
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-
植最有效植入的造血干细胞移植物, 而CD 34细胞数量少, 发育不良, 功能低下, 重建造血过程缓慢, 临床低效植入, 是不可取的。作为临床移植物细胞, 决不是分化愈早愈好, 而应是已分化在某一个阶段的干细胞, 如已经表达CD 34抗原的造血干细胞。骨
-髓中所含的CD34细胞主要是各个胚层来源的各种非造血成体干细胞, 包括间充质干细胞、神经干细胞、心肌干细胞、肝脏干细胞等等。而那些中胚层干
-细胞已决定造血分化方向的CD 34细胞, 仅占微不
+
足道的一小部分。最初人们以为CD 34细胞中全
+
是造血干细胞, 多年来大量实验数据证实:CD 34细胞中98%以上是早期和晚期的造血祖细胞, 而造
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血干细胞仅仅占CD 34细胞2%以下。所以,
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CD 34细胞一致公认为造血干祖细胞。但乳腺癌
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细胞也是CD34, 所以乳腺癌病人放化疗后不适于
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CD 34造血干细胞自体移植。
造血干细胞移植实际是造血干/祖细胞的移植
这些造血祖细胞在临床干细胞移植中占有极其重要的意义, 因为造血祖细胞植入之后可以在体内增殖并分化, 晚期的造血祖细胞更快地分化为有功能的成熟血细胞, 有助于血象提前回升。这挽救了造血干细胞分化成熟为血细胞的漫长过程造成的临床感染出血的致命危机, 减少移植相关死亡率, 而使造血干细胞临床移植长期重建造血最终获得成功。所以, 一个理想的造血干细胞移植物, 必须含有大量的造血祖细胞, 是临床植入成功的关键。所谓造血干细胞移植实际上是造血干/祖细胞移植。长期重建造血所需要植入的造血干细胞并不多, 而需要的造血祖细胞数量却是巨大的。这也是经过30多年的研究之后才形成的正确概念。
脐血作为造血干细胞新供源的发现与应用
1995年美国B roxm eyer 在基础研究中第一个发现脐血富含造血干细胞后, 立即和法国圣路易医院G luckm an 合作, 1997年发表第一例脐血临床移植
[16]
报告, 造血干细胞有又增加一个供源, 引起全世界干细胞学术界的关注。1999年由纽约政府出资办的世界第一个脐血造血干细胞库在纽约市血液中心成立; 这一个脐血库至今仍为国际脐血库的权威, 储存量和临床应用的成功率始终居世界之首。其原因是政府保证每年的经费支持, 使脐血库可以坚持不以赢利为目的, 从来不介入商业性赢利性的经营手段的正确方向, 发表了大量富有国际指导性的学术论文。从此, 全世界都兴建脐血库, 欧洲发展了47, 血库都是政府和企业界无偿资助的非赢利性的为病人谋福利的公益事业单位, 它们坚持不谋私利的方向, 骨髓移植供者的HLA 必须和病人全相合, 而脐血移植供者和病人的H LA 配型即使一个或两个位点不相合也可以安全植入, 而且在一个存有4500份脐血的库, 病人从中找到4/6以上位点相符脐血的几率是非常高的(>95%), 脐血在临床的移植效果相似于非血缘性HLA 全相合骨髓移植。再加上一旦在脐血库找到合适的脐血, 立即可以供应。然而要找到一个可以应用的非亲缘性HLA 全相合供者的骨髓往往等候很长时间, 甚至找不到。所以大力发展脐血移植对需要进行造血干细胞移植的儿童患者是非常必要的。国外脐血库事业的发展和我国形成鲜明的对比。由于我国大多数脐血库得不到政府和和企业界任何无偿捐助, 全靠自己创收来维持, 日常开支维持都十分艰难。呼吁各地脐血库的上级政府或红十字会能定期拨款或募集捐款基金, 给予经费上必要支持, 拯救正面临崩溃夭折的现代高技术医学新兴的公益事业吧!
现代干细胞工程和移植物工程可能研制成造血干细胞的! 理想移植物∀
经过了约20年的免疫血液学基础研究, 到21世纪人们才开始了解T 细胞不同新亚群以及它们分别于造血干细胞移植的植入、GVHD 和GVL 等环节中进行调控。基础研究从这里进一步探索, 再结合新兴的成体干细胞工程技术, 在移植物中加入由干细胞工程诱导分化而制备的适当比例的各种亚型的T 细胞, 和经过培养扩增的一定量的造血干细胞和足够大量的造血祖细胞, 再加入单倍体相合的亲缘供者或HLA 相合非亲缘供者的适量间充质干细胞, 用! 移植物工程∀可以制备成造血干细胞! 理想移植物∀, 也是未来干细胞工程的一个发展方向。干细胞工程可以探索制备M HC 低表达的组织细胞, 以减免免疫排斥。从当前造血干细胞临床移植发展走向来看, 结合免疫治疗的细胞治疗走向多元化是21世纪的发展的必然趋势, 临床治疗恶性血液病的造血干细胞移植(未来的元化细胞治疗) 中, 高植入率/低GVHD /高DVL 三者在每一病例中共同实现的梦想, 将在本世纪成为现实。
从成体干细胞体外诱导分化造血或生殖干细胞探索的科学意义重大, 但难度也最大。在急功近利的管理体系诱导下, 一些血液学家们弃难就易地放弃了本来是血液学范畴的造血干细胞工程的中/长,
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化神经/肝/胰/心肌/骨/软骨等成体干细胞的研究。
虽然实验取材于骨髓、脐血等, 但这些血液学家们却离开了血液学, 跨入了与造血干细胞无关的陌生领域, 进行所谓! 干细胞可塑性研究∀, 其实是重复性的技术工作, 远期目标模糊不清, 将面临研究思路枯竭的险境。在自己熟悉的专业领域中引进其它专业技术本来是很必要的, 但在研究方向上务必扬长避短, 坚持和发挥本实验室原有的专业优势和长远目标。这是当前国内外血液学干细胞基础研究发展中的一个问题。然而, 终有一天造血干细胞工程和异基因造血干细胞! 理想移植物∀工程成为21世纪血液学研究和发展的一大重点, 将使干细胞工程耳目一新, 进入一个新时代。
骨髓干细胞不再仅仅是造血干细胞
1989年C ap l a n 及其同事们发现大鼠间充质干细胞
[17]
(mesenchy m a l ste m cel, l M SC ) 。这是同一实验室后来发现人类间充质干细胞的前奏。间充质干细胞的发现, 表明成体骨髓中不但含有造血干细胞, 还共存一种非造血成体干细胞(nonhe m a t o po ietic adu lt ste m ce lls), 是非同小可的科学发现。可惜在当初发现间充质干细胞时并没有引起学者们关注和重视。谁也没有想到非造血成体干细胞在全身组织普
[18]
遍存在的可能。到1999年该实验室D enn is 和
[19]-P ittenger 分别发现人骨髓中CD 34间充质干细胞(m e senchym a l ste m ce l, l M SC ), 这是第一次从人
骨髓中证实非造血的成体干细胞, 无疑地有划时代的科学意义。从此, ! 骨髓干细胞∀一词不应该再是等同于造血干细胞的代称, 而是骨髓中所有造血和非造血成体干细胞的总称, 是21世纪的新理念。! 成体∀与! 成年∀概念不同, 但英文都是! adu lt ∀。当胚胎发育到头 躯干 四肢和体内主要脏器都成形时, 称为成体发育阶段。当全身各器官发育全面成熟时, 是成年阶段。A dult ste m cells 译为成体干细胞, 而不是成年干细胞。当然, 从胚胎成体阶段到出生后直至老年, 体内的胚胎发育遗留在全身组织中残留的的胚胎干细胞和所有各胚层干细胞都称为成体干细胞。
作者们创建了M SC 贴壁分离富集并扩增骨髓
-中CD 34细胞的方法和多参数检测法。要指出的是, 同一实验室在20多年前发现了小鼠CFU f 。也就是靠这个起点, 他们经过几代人执著不断深入探索之后, 终于发现了人间充质干细胞(HM SC ) 。间充质干细胞是全身结缔组织的干细胞, 包括骨、软细胞等。M SC 有免疫调控功能, 加强供者异基因造
血干细胞表面某些黏附分子受体的表达因而促进植入; M SC 又可降低供者T 细胞的异基因识别反应, 从而减轻GVHD 等。在临床, 同一供者或单倍体相合的亲属M SC 和造血干细胞共输注有良好的前[20, 21]景, 特别是脐血移植。
干细胞基础研究的正常发展始终是不断纠正误区的过程
造血干细胞体外扩增的注定性失败, 脐血中需要扩增的是造血祖细胞而不是造血干细胞
由于要解决脐血有核细胞数量的不足而影响有效地用于成人, 1998年以后在世界范围开展了脐血造血干细胞体外扩增的研究, 投入了大量人力财力而最后以失败而终。它再一次有力地证实, 不对称性有丝分裂使造血干细胞能不断分化产生新的造血祖细胞, 而造血干细胞本身却不能扩增。体外扩增的结果只能扩增各类造血祖细胞, 同时培养中外加的可扩增造血祖细胞的细胞因子也能使干细胞丧失自我维持的特性而分化殆尽, 因此至今仍然没有人报告用体外扩增后的脐血而移植治疗成功的。移植物中保证长期重建造血和免疫的造血干细胞是必须有的。但基础研究表明, 移植物造血干细胞的数量不求多。其实脐血单个核细胞中所含的造血干细胞数量也足够用于儿童和成人的移植。脐血中缺少的、也是需要扩增的是造血祖细胞而不是造血干细胞。从事脐血干细胞体外扩增注定失败的原因是学术思路中存在误区、干细胞与祖细胞界限混淆不清以及造血干细胞检测很困难等。
临床造血干细胞基因治疗遭重大挫折的原由
1997年造血干细胞基因治疗热潮在美国的突然掀起, 许多大企业争相投资, 达数十亿美元。世界范围学术界曾经一度把基因治疗看作是治百病的希望, 加上投资者和媒体的狂热和炒作, 基因治疗一时被描绘为能治疗任何疾病的方法。造血干细胞被认为是基因治疗中可长期携带目的基因的理想载体。不料由于造血干细胞大多数处于G 0静止期, 而且人类造血干细胞表面又不表达能和病毒载体结合的受体, 造血干细胞又没有分离提取的方法等原因, 使目的基因转染造血干细胞成为至今也未解决的一大难题。造血干细胞基因治疗在发达国家的临床试验几乎都失败了。学者们在无情的科学实践面前终于, ,
造血干细胞研究发展历史引发的思考 729
然地把十分复杂的基因治疗在临床推广应用, 是失败的原因。基因治疗另一个尚未解决的难题是如何用药物操纵调控在病人体内用于治疗的目的基因表达水平, 也是个基因治疗应用临床之前必先解决的基础。基因治疗临床发展中的挫折是由于忽略了必要的有关的基础研究及药业界急于竟相投资赢利的浮躁动机造成的。然而, 基因治疗仍然是本世纪医学研究的重要方向之一。
成体干细胞的认识误区引发的一场风波和教训
对成体干细胞普遍存在许多认识误区, 都应当澄清。目前的M SC 和其它各类非造血成体干细胞的贴壁培养分离方法都是一种富集, 谈不上! 纯化∀, 决不是克隆技术。经过长期培养扩增后, 所收获的大部分甚至全部是M SC 的后代, 即各类间充质祖细胞和趋于成熟的各类结缔组织细胞。它们和干细胞不同, 即开始表达各种表面抗原, 使检测M SC 成为可能。每次收获的M SC 必然和许多种类的非造血成体干/祖细胞混合在一起的, 因为它们共有贴壁生长和CD 34等特点。它们在分化为祖细胞和各类组织细胞之前, 即在它们的干细胞阶段, 都不表达特异性的表面标志。所以, 分离纯化任何一类的成体干细胞是很难作到的。任何一类成体干细胞(包括造血和非造血的) 都因其不对称有丝分裂而不可扩增, 而且它们都具有细胞分裂和分化同时进行的特点, 使各类干细胞的克隆制备成为不可能。可惜, 国内外同行中普遍地有认识上的误区, 因而带来了实验设计不严密而失败, 或对实验结果做出了错误的结论。
1999年某些国际权威杂志同时发表了几篇成体干细胞的重大发现的报告, 却不幸都被作者们假设为干细胞! 横向分化∀和! 去分化∀等。这些缺乏科学证据的论点引起了沸沸扬扬的风波, 一时之间无数前人的细胞生物科学实践和细胞遗传科学的原理似乎全被践踏, 各类不同的组织细胞几乎都可以任意地相互转变, 生物技术似乎成了舞台表演的魔术。
2002-2004年国际学术权威杂志接二连三地发表许多设计周密的杰出的研究论文, 有力地揭露了横向分化、去分化等假设的无稽性。同时, 成体干细胞的存在也被更多的科学实践所证实。曾经提出横向分化、去分化等论点的学者们又不能拿出任何令人信服、可以被同行重复出来的科学研究结果, 于是其中不少实验室近两年来不得不下马或改弦更张, 这个世界范围的风波终于慢慢地平息下来。其实, 证实成体干细胞存在报告的学者, 也包括那些提-
作者们对成体干细胞的无知, 误以为天然组织细胞
只是纯一性的%克隆&, 无视体内任何组织都是异质性的, 即每个组织中都是由多种细胞并存的基本事实, 误认为肌肉中只有肌肉细胞, 脂肪中只含脂肪细胞, 骨髓中仅有造血细胞。他们根本不考虑成体动物的全身组织中都残存各类胚胎性干细胞的可能性, 。他们轻易地抛弃经无数科学实践证实了的细胞遗传学基本原理, 对自己实验证实成体干细胞存在的事实却视而不见, 偏要提出缺乏直接实验证据又没有生物医学旁证的异想天开假设, 荒诞地提出肌肉细胞可以变造血干细胞, 脂肪细胞可以变成神经干细胞, 造血干细胞可以横向分化为心肌干细胞等等。! 肌肉移植将取代骨髓移植∀的大标题也上
[22-29]
了我国报纸。有关成体干细胞的划时代科学发现和横向分化、去分化等错误假设, 曾搅乱了一部分人的视线, 但在国外只经过大约5年时间就基本平息了。既不靠唇枪舌战, 也不要什么权威的裁判, 而是在各国同行们的积极参与下, 靠严谨的科学实践进行验证, 让事实说话。凡是粗疏草率设计的科研结果是其他同行们不可能重复出来的, 其真伪不难被人们识破。科学实践是检验真理的唯一标准, 也是推动人类科学进步的原动力。对! 干细胞可塑性∀的误读
干细胞的可塑性即是干细胞的分化方向的可选择性。干细胞分化方向是分化基因所! 决定∀的, 不可曲解为随意的可变性。最原始的胚胎桑葚期囊胚内层的少量细胞, 称为胚胎干细胞(e m bryon ic ste m ce l, l ESC ), 它具有全面地向任何一个胚层分化的潜能, 即全面的可塑性。在体外培养中, ESC 在适当的条件下, 可能诱导成某一个胚层的干细胞。但是, 由于现代胚胎学对基因如何! 决定∀其分化方向的机制知之甚少, 所以用实验方法调节干细胞分化方向的人为能力是很有限的。随着ESC 胚层干细胞 组织干细胞的逐步分化, 基因对分化! 决定∀的方向的可选性也逐步加大限制, 使细胞分化方向可选择的空间逐步缩小。各胚层干细胞只限于在本胚层内选择分化方向, 组织干细胞限于本组织内选择分化方向。例如, 造血干细胞限于向髓/淋巴系两系造血细胞分化, 间充质干细胞只限于在各个结缔组织细胞中选择分化方向。虽然都来自中胚层, 造血干细胞和间充质干细胞作为两种不同的组织干细胞永不可能互相转化。但有人把各类组织干细胞都当作
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地任意变来变去, 把干细胞体外诱导技术当成是万
能的, 甚至想跨胚层、跨组织, 更甚至! 去分化∀逆向
[23]
地乱变, 这在严格的实验中注定要失败。非造血的成体干细胞临床应用中存在的问题
2002年从全身各类组织中陆续发现各类非造血的成体干细胞, 临床开展了应用自体骨髓成体干细胞治疗各种非造血组织损伤、心肌缺血、肢体缺血坏死等等。我国政府十分重视干细胞工程的研究, 建立了若干组织细胞工程中心, 开展了自体成体干细胞/胚胎干细胞体外诱导扩增临床治疗需要的非造血的各类干细胞和组织细胞的研究。由于发展过于迅速, 有的临床方案设计十分粗糙, 且带有一定的盲从性和近视性, 研究停留在低水平的重复或模仿上; 有些临床研究缺乏正确的科学理论指导和探索方向, 以致难以总结经验, 难以进一步提高疗效。
白血病都是干细胞疾病吗? 发生白血病恶变的造血祖细胞竟被称为白血病干细胞
由于造血干细胞无法分离纯化, 体内检测技术的过于复杂, 使病理性造血干细胞的基础研究十分困难, 因此产生了一些流传很广又很久的认识误区。从30年前迄至今日国内外血液学教科书中把所有类型的白血病统统归为! 干细胞疾病∀, 似乎各类白血病的基因突变都发生在干细胞水平。说白血病病变都起源于造血干细胞水平是数十年前的假设, 至今还没有科学根据。事实上, 临床常见的各类白血病罕见髓系和淋巴系细胞同时受累的。绝大多数各类白血病病变局限于髓系, 或局限于淋巴系。慢性髓系白血病受累的有粒、红、巨核等多个系, 一般不累及淋巴系。多数白血病细胞仅仅限于某一个细胞系, 甚至只限于某一个系的某个分化阶段, 例如早幼粒细胞白血病。由于白血病祖细胞处于祖细胞分裂周期之中, 细胞染色体畸变或基因突变往往发生在有丝分裂中。白血病祖细胞一般对多数化疗药物敏感, 而且体内还存在没有发生白血病变的正常造血干细胞, 化疗效果自然也较好。相反, 白血病起源于造血干细胞水平的就不同了, 干细胞白血病在临床表现是髓 淋巴两系同时或先后受累, 或白血病细胞表型跨越髓 淋巴两系, 而且阳性细胞率都较高。多数处于静止期的白血病干细胞, 对一般化疗药不敏感, 治疗效果很差, 病程很短而凶险, 预后坏。幸好, 病变发生于造血干细胞水平的白血病是极少见的。恶变而扩增的造血干细胞被称为白血病干细胞克隆; 恶变而扩增的造血祖细胞当然被称为白血病祖A ! 干细胞(LSC ) ∀的! 教育∀论文, 仍然错误地把白血病祖细胞说成白血病干细胞, 甚至违反逻辑地说! 白血病干细胞起源于造血祖细胞∀的奇谈。这表明国内外部分血液学作者至今仍不能区分兼有髓 淋两系全面分化潜能的造血干细胞和局限分化某系的造血祖细胞。这也说明即使在同行中澄清一个误区仍需要很长时间, 甚至经过好几代人。何况参加干细胞研究的人员来自不同的专业, 每人的知识面有局限性。历史将证明, 白血病干/祖细胞的认识误区必将随病理干细胞基础研究的发展而进一步澄清。
科学探索经常卷入误区是正常的
在人类科学的发展中, 由于实践不足和知识片面性所致的各种认识上的误区经常发生, 是很正常的。人皆有之, 不足为奇。和任何科学技术的进步一样, 干细胞研究的发展史就是一个不断纠正片面性认识的过程史, 也是无数科学家成长的过程史。人类对客观事物规律的认识过程, 总是从片面逐步走向全面的。真正的科学家不惟书、不惟上, 只相信科学事实, 尤其是经同行们都能重复出来的科学实践的结果, 因而也勇于在实践中正视和否定自己认识中的误区, 知错即改, 在漫长的探索路上一步一步地追求真理。
我国干细胞研究发展中出现的浮躁虚夸
! 器官克隆∀可行吗?
当代干细胞工程技术可以在体外培养中诱导成体或胚胎干细胞生成并扩增某些组织细胞, 供临床细胞治疗之用。所以又称为组织或细胞工程。现代生物科学家已经掌握了个体动物的克隆技术, 把转导了异体体细胞DNA 单链的卵细胞植入到动物的假孕子宫内膜里。克隆胚胎的整个发育成长过程都是在天然的母体子宫中自然完成的。当代生物科学对胚胎发育中每一步决定分化过程的基因调控机制还毫无所知, 有人却奢谈控制胚胎在子宫中发育, 只让某一个实质器官生长, 最后只分娩出某一种实质器官来, 即所谓! 器官工程∀或! 器官克隆∀, 这是当代技术条件下不可能实现的梦想。现代高科技可以克隆动物整体或某些体细胞, 却不可能克隆出单独的实质脏器。在干细胞工程中使用管状模拟支架, 能否使血管外皮、弹力纤维、肌层和内皮等细胞, 合理分层而协调地在支架上生长, 塑造出有复杂的细胞结,
造血干细胞研究发展历史引发的思考 731
很难说。至于塑造成可以在体内受内分泌和植物神经支配而张弛自如的血管, 而且血管壁各种细胞可以长久自我更新稳定生长, 在当前还没有科学根据及可行方法, 更不要奢谈塑造具有复杂结构和功能的实质脏器了。国内有一位! 学者∀宣称他的干细胞工程可以! 在5年内分别制成206种实质器官∀, 受到我国生物学专家们公开严正质疑。令人吃惊的是, ! 器官工程∀字样竟然一度出现在某些科技基金的干细胞工程招标项目之中; 一个缝在大鼠背部的塑料制成的人外耳壳, 也曾冒充为! 干细胞器官工程成果∀这一虚假宣传竟然上了我国各地电视荧屏和报纸。
科学实践受当前条件限制, 有可行的, 也有不可行的。大胆假设和实事求是的科学精神相结合是科学家成功的要素。把梦想说成现实、把不可行吹嘘成可行等轻浮虚夸的作风是与科学家的严谨作风水火不容的。
由于急功近利和浮躁等因素, ! 快拿成果∀竟成为我国选题的普遍原则, 中长期的医学基础研究已几十年乏人问津, 这带来了基础医学研究整体泡沫化和发展缓慢, 严重妨碍我国进入世界医学科学强国的行列。
十分有益于年青科学人才成长和首创性科学技术加快发展的环境和管理体系。我国干细胞基础和临床国家整体研究水平进入干细胞科学世界列强的愿望, 才可能成为现实。
注:本文是作者在2004年9月! 中华医学会全国血液学大会的闭幕报告发言稿∀的基础上撰写的
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历史的启示和当前大好形势下的憧憬
上面列举了一些令人担忧的问题, 但近年来出现的科技发展大好形势也是十分令人鼓舞的。2003年以来我国血液学界已经涌现出一批新一代的学术带头人, 他们在#中国实验血液学杂志∃陆续不断地发表了有国际先进水平和高度首创性的优质科研论文, 并通过M E DL I NE 被世界同行们引用, 正预示着我国基础与临床血液学、免疫血液学、分子血液学和干细胞科学更大的发展高潮可能到来。
本文中列举了许多国外诺贝尔奖的获得者, 他们分布在不同的国家, 却几乎在十分相似的环境下成长的。他们都是在无名小卒的年代就开始发表有重大科学价值的发现或发明; 他们的一篇研究生或博士后论文可以被国际权威性大杂志录用发表而一举成名。在一个公平竞争和学术民主的环境下, 他们自己原创性的科学实践没有因人微言轻而受歧视或压制。在他们学术成长过程中, 没有行政或政治干预。他们个个都接受过严格的一丝不苟的科研素质教育和训练, 但他们在中小学时代就开始培养善于独立思考和敢于质疑创新的精神。
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