实验一 氨基酸总量的测定(发园艺.设施等)
实验一 植物组织中氨基酸总量的测定(茚三酮比色法) 一、目的意义和要求： 二、原理： 三、植物材料：
1、发芽水稻种子：用水(对照) 、50mmol/L NaCl和500mmol/L NaCl溶液分别浸种２天后，室温（28℃）下萌发２天。
2、每组用２种材料，即１种对照和１种NaCl 处理。
四、试剂配制 :
1. 水合茚三酮试剂: 称取0.6克再结晶的茚三酮置烧杯中，加入15毫升正丙醇，搅拌使其溶解。再加入30毫升正丁醇及60毫升乙二醇，最后加入9毫升pH5.4的乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，置冰箱中保存备用，10天之内有效。
2. 乙酸—乙酸钠缓冲液（pH 为5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4克，加100毫升无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至原体积的一半。冷却后加30毫升冰乙酸，用无氨蒸馏水稀释至100毫升。
3. 标准氨基酸：称取80℃下烘干的亮氨酸46.8毫克，溶解在10%的异丙醇中，并用10%异丙醇稀释至100毫升。取此液5毫升，用蒸馏水稀释至50毫升，即为每毫升含氮5微克的标准液。
4.0.1%抗坏血酸：称取50毫克抗坏血酸溶于50毫升无氨蒸馏水中，随用随配。
五、操作步骤：
1、样品制备：称取水稻萌发种子1克于研钵中，加入2ml10%乙酸、石英砂，充分研成匀浆，再加入3ml10%乙酸，研磨均匀后用蒸馏水洗入100ml 容量瓶并用蒸馏水定容 至100ml 。混匀后用干燥滤纸过滤到三角瓶中备用。
2、标准曲线的绘制： 取8支试管，按下表编号、加试剂。
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2、样品测定： 取3支20ml 刻度试管，按下表编号、加试剂。
加完试剂后，混匀，盖上玻塞，置沸水浴中加热15分钟，然后取出放在冷水浴中迅速冷却并经常摇动，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直至溶液呈蓝紫色时，用60%的乙醇定容至20毫升，摇匀，用光径为1厘米的比色杯，在波长570nm 下测定其消光值，制作标准曲线。
3、样品测定：取2支试管，分别加入2亳升过滤液，加入0.1%抗坏血酸0.1毫升，水合茚三酮3ml, 混匀加盖，置沸水浴加热15min ，取出后用冷水迅速冷却，用60%乙醇定容至20ml 。混匀后用标准曲线的1号管为参比，于570nm 波长下比色，测定吸光度。
六、结果计算：
获得结果按下式计算出每克鲜样品中氨基态氮的含量（µg/g鲜重）。 稀释总体积
C(μg) ×------------- 测定时加样量
氨基态氮含量（μg/克鲜重）=------------------------
样品重（克）
式中：C 为由标准曲线查得每毫升样品中氨基态氮的微克数。
－1
氨基态氮含量（μg ·g ）＝C(μg) ×V T /(Vs×W ）
＝C ×100/1×1
式中：C －查标准曲线值（µg ）；
V T －提取液总体积（ml ）； W －样品鲜重（g ）；
Vs －测定时加样量（ml ）。
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七、实验要点：
1. 测定前所用的烧杯、试管等玻璃仪器必须干净、烘干。 2. 实验所用的蒸馏水必须是无氨水。
3. 样品要充分磨成匀浆并用无氨水少量多次将匀浆洗入100毫升容量瓶，过滤要用干燥
滤纸过滤。
4. 空气中的氧干扰显色反应的第一步。以Vc 作为还原剂，可提高反应的灵敏度并使
颜色稳定，但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应，使溶液显色过深，故应严格掌握加入抗坏血酸的数量。
5. 标准曲线应在测定样品的同时做，以减少操作及反应条件的误差。
6. 加热时温度影响显色的稳定性，所以一定要水沸腾后才能将试管放入加热，而且水
浴锅的水位一定要高于试管内试剂的高度。
7. 试管从沸水浴取出，一定要用冷水迅速冷却后才能加入乙醇，因加热时形成的红色
还原型茚三酮，在冷却过程中被空气中的氧氧化而退色，而茚三酮和氨基酸的蓝紫色反应物仍存留着，并变得更加明显。
8. 茚三酮与氨基酸反应所生成的颜色在1小时内保持稳定，所要抓紧时间比色。 9. 反应灵敏度在很大程度上与氢离子浓度有关。最适pH4.5，应严格控制。
谷物籽粒等含蛋白的样品可使用酸水解法或其他水解方法将蛋白质水解，采用本方法测定蛋白质水解液中氨基酸的总量，可计算出样品中的蛋白质含量。
八、思考题：
1. 茚三酮显色法测定过程受哪些因素影响？
2. 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸除去蛋白质的原理是什么？ 3. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？抗坏血酸在测定中的作用是什么？
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