试验方法及溶液配置

试验方法

土壤理化性质

土壤pH 值：Soil pH was determined on a 1:10 soil: water slurry (15 min shaking) using a glass electrode (Bradley RL, Grenon F. 2006. Evidence that straw does not increase the mobilization of N from decomposing salal (Gaultheria shallon Pursh.) leaf litter. Soil Biology & Biochemistry 192(38): 191–194).

土壤湿度：Soil water content was determined by removing approximately 5–10 g (wet weight) of soil and weighing it before and after oven-drying at 105 °C for 24 h.

微生物培养基 细菌培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂(BPA)培养基(牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g, NaCl 5 g ，水1000 mL, pH 7.2-7.4)，28 °C 培养2 d后挑菌。样品稀释梯度为10−4。

真菌培养基：虎红培养基(5 g L−1 peptone, 18.5 g L−1 agar, 10 g L−1 glucose, 1 g L−1 KH 2PO 4, 0.5 g L −1 MgSO 4, 0.0133 g L −1 Rose Bengal, and 0.1 g L −1 chloramphenicol) ，25 °C 培养5 d后挑菌。样品稀释梯度为10−2。

放线菌培养基：高氏1号琼脂(GA)培养基(淀粉20.0 g，KNO 3 1.0 g，K 2HPO 4 0.5 g ，MgSO 4 7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g，FeSO 4.7H 2O 0.01 g，琼脂18 g, 水1000 mL，50 μg/mL K2Cr 2O 7, pH 7.2-7.4)，28 °C 培养7 d后挑菌。样品稀释梯度为10−3。

纤维素分解菌培养基(羧甲基纤维素钠培养基) ：20 g L−1 CMC, 15 g L−1 agar, 2 g L −1 KNO3, 0.5 g L−1 MgSO4, 1 g·L −1 NaCl, 1 g L −1 Na2HPO 4, 1 g L−1 KH2PO 4, and 0.2 g L−1 Congo-red。28 °C 培养6 d。每个土样(微生物类群) 选取3个浓度梯度，每个浓度梯度3次重复，取其平均数进行计算作为该土样的微生物数量(Shao YY, Wang ZY, Zou L, Wu SP. Effect of chlorothalonil on soil microbial communities of Larix artificial shelter-forest. Acta Ecologica Sinica 2011, 31(3): 819-829 (In Chinese); China Academy of Nanjing Institute of Soil Microbial Room ．Soil Microbiology Research. Beijing:Science Press (In Chinese)) 。

固氮菌培养基：蔗糖10 g 、K 2HPO 4·3H 2O 0.5 g 、NaCl 0.2 g 、CaCO 3 1 g 、MgSO 4·7H 2O 0.2 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 7.0~7.2), 28 °C 、100 rpm摇床振荡培养3 d (Sun JG, Zhang YC, Xu J, Hu HY. Isolation, identification and inoculation effect of nitrogen-fixing bacteria Sphingomonas GD542 from maize rhizosphere. Chinese Journal of Eco-Agriculture 2010, 18(1): 89 93 (In Chinese)) 。

氨化细菌培养基：2 g·L –1硫酸铵, 0.75 g·L –1磷酸氢二钾, 0.25 g·L –1磷酸二氢钠, 0.03 g·L –1 7水硫酸镁, 0.01 g·L –1 4水硫酸锰, 5 g·L –1碳酸钙, pH 7.0. 29 °C 培养14 d (Lin T, Shen W, Hu JW, Huang XF, Jin M. Study on the microorganisms related with nitrogen cycle in sedmients of Hongfeng Lake. Agricultural Science & Technology, 2010, 11(11-12): 186-190).

硝化细菌培养基：NaNO 2 1 g, Na2CO 3 1 g, NaCl 0.5 g, K2HPO 4 0.5 g, MgSO4 0.5 g, FeSO 4 0.4 g, H 2O 1 000 mL, pH 7.2. 28 °C 培养3 d (Li JW, Zheng JL, Chao FH, Wang XW, Jin M, Gu CQ. Isolation and identification of nitrite-oxidizing bacteria. Chin J Appl Environ Biol 2004, 10(6): 786~789 (In Chinese)).

反硝化细菌培养基：KNO 3 2 g, 柠檬酸钠5 g, K2HPO 4 1 g, MgSO4·7H 2O 0·2 g, 蒸馏水1 000 mL, 121°C, 灭菌20 min. 28°C 培养3 d (WANG L, LI J, KANG WL, CHEN YZ, GUO TZ. 2009. Denitrifying bacteria isolated from river sediment and its nitrogen and phosphorus removal capacity from river water . Environmental Science 30(1): 91-95 (In Chinese)).

磷细菌培养基：NaCl 0.3 g, MgSO 4·7H 2O 0.3 g, MnSO 4·4H 2O 0.3 g, KCl 0.3 g, (NH4) 2SO 4 0.5g, FeSO4·7H 2O 0.03 g, Ca3(PO4) 2 5.0 g, 蔗糖10g, 琼脂15~20 g, pH值7.0~7.5, 蒸馏水1000 mL。称取5 g土壤鲜样于45 ml无菌水中振荡10 min, 按10倍稀释法依次稀释至10‒3、10‒4和10‒5倍, 各取0.1 ml, 涂布于培养基平板上. 28°C 恒温培养箱中培养3 d (Xing SZ, Guo HL, Wang JF, Zhou Y, Xiao X. 2010. Isolation, purification, and phosphate-solubilizing capability of phosphate-solubilizing microorganism in wheat field. Journal of Biology 27(5): 19-22. (In Chinese)) 。

微生物计数的基本单位：称取10.0 g土壤，105 °C 烘6～8 h至恒重，得到土壤的干重，获得土壤含水率，从而获得微生物计数的基本单位CFU/g干土(CFU，colony forming unit) ，即:土壤微生物数量(CFU/g)=每皿平均数菌落×稀释倍数/干土质量分数[湛方栋，陆引罡，关国经，等．烤烟根际微生物群落结构及其动态变化的研究. 土壤学报, 2005, 42(3): 488-494.]。

土壤酶活

纤维素酶活性：称取1 g新鲜土样，加5 mL(2.844+2.156) Na2HPO 4-柠檬酸缓冲液(pH 5.5)、1.5 mL甲苯、30 mL 0.5%羧基纤维素钠，室温培养30 min。取1 mL上清液，加1 mL 5%三氯乙酸、1 mL 1 mol L−1 NaOH、4 mL 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min ，冷却，测定OD 540值，以不加土样做空白对照。以光吸收值作纵坐标，对应标准D-葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。一个单位的酶活性定义为mg glucose mL−1 30 min−1 (Ghose TK. 1987. Mesurement of cellulase activity. Pure Appl Chem, 59(2): 257-268.) 。

转化酶活性：称取1 g 风干土样，加15 mL 8%蔗糖溶液、5 mL (2.844+2.156) Na 2HPO 4-柠檬酸缓冲液(pH 5.5)和0.2 mL甲苯，混匀，37 °C 培养24 h，取1 mL上清液，加3 mL 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min，冷却，测定OD 508值，以不加土样做空白对照。取1 mL 浓度分别为1 mg·mL −1、2 mg·mL −1、5 mg·mL −1和10 mg·mL −1的D-葡萄糖标准溶液，加0.2 mL甲苯，混匀，37 °C 培养24 h，加3 mL 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min ，冷却，测定OD 508值，以光吸收值作纵坐标，对应标准D-葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。一个单位的酶活性定义为1 g 土样24 h 内分解产生1 mg 葡萄糖所需的酶量(Ohshima T, Tamura T, Sato M. 2007. Influence of pulsed electric field on various enzyme activities. Journal of Electrostatics 65: 156–161. ； Ge GF, Li ZJ, Fan FL, Chu GX, Hou ZN, Liang YC. 2010. Soil biological activity and their seasonal variations in response to long-term application of organic and inorganic fertilizers. Plant Soil 326: 31–44) 。

硝酸还原酶：称取1 g新鲜土样，加5 mL(4.61+0.39) Na2HPO 4-柠檬酸缓冲液(pH 7.5) 和5 mL 0.2 mol·L −1 KNO3，静置20 min，吸取反应溶液1 mL，加2 mL对氨基苯磺酸和2 mL α-萘胺试剂，混匀，静置20 min ，测定OD 520值，以不加土样做空白对照。取1 mL浓度分别为1 μg·mL−1、2 μg·mL−1、5 μg·mL−1和10 μg·mL−1的NaNO 2标准溶液，加2 mL对氨基苯磺酸和2 mL α-萘胺试剂，混匀，静置20 min ，测定OD 520值，以光吸收值作纵坐标，对应标准NaNO 2溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。一个单位的酶活性定义为1 g土样1 min内分解产生1 μg NO 2-所需的酶量。(Daniel RM, Curran MP. 1981. A method for the determination of nitrate reductase. J Biochem Bioph Meth 4: 131–132. ) 。

脲酶：称取1 g风干土样，加1 mL甲苯，室温静置15 min，加10 mL 10%尿素和10 mL(7.5+2.5) Na2HPO 4-柠檬酸缓冲液(pH 6.7)，混匀，37 °C 培养24 h，取3 mL 上清液，定容至20 mL，加4 mL苯酚钠和3 mL次氯酸钠，震荡，静置20 min，定容至50 mL ，测定OD 578值，以不加土样做空白对照。取3 mL 浓度分别为1 mg·mL –1、2 mg·mL –1、5 mg·mL –1和10 mg·mL –1的(NH4) 2SO 4标准溶液，定容至20 mL，加4 mL苯酚钠和3 mL次氯酸钠，震荡，静置20 min，定容至50 mL，测定OD 578值，以光吸收值作纵坐标，对应标准(NH4) 2SO 4溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。一个单位的酶活性定义为1 g土样24 h内分解产生1 mg 氨基氮所需的酶量。(Nannipieri P, Ceccanti B, Cervelli S, et al. (1980) Extraction of phosphatase, urease, proteases, organic-carbon, and nitrogen from soil. Soil Sci Soc Am J 44:1011−1016.)

磷酸酶：称取1 g新鲜土样，加0.2 mL甲苯溶液、5 mL 0.5%磷酸苯二钠和5 mL相应的缓冲液(碱性磷酸酶AkP 用pH 10.0的缓冲液，酸性磷酸酶AcP 用pH 5.0的缓冲液)，混匀，盖紧瓶塞，横放，37 °C 振荡培养24 h，离心，取0.5 mL上清液，加2.5 mL 2.5%铁氰化钾和2.5 mL 0.5% 4-氨基氨替吡啉溶液，再加入10 mL 水，振荡混匀，静置30 min ，测定OD 570值。取0.5 mL 浓度分别为1 μg·mg−1、2 μg·mg−1、5 μg·mg−1和10 μg·mg−1的苯酚标准溶液，加2.5 mL 2.5%铁氰化钾和2.5 mL 0.5% 4-氨基氨替吡啉溶液，再加入10 mL 水，振荡混匀，静置30 min ，测定OD 570值，以光吸收值作纵坐标，对应标准酚溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，并建立回归方程。一个单位的酶活性定义为1 g土样24 h 内分解产生1 mg P2O 5所需的酶量。(Kandeler E, Tscherko D, Spiegel H. Long-term monitoring of microbial biomass, N mineralisation and enzyme activities of a Chernozem under different tillage management. Biol Fert Soils 1999;28:343-351.)

溶液配置

0.2 mol·L -1 KNO3：称取20.22 g KNO3(G：101.10) ，定容至1 L。

苯酚钠：称取62.5 g 苯酚溶于少量酒精中，加2 mL 甲醇和18.5 mL 丙酮，

酒精定容至100 mL(A液) 。称取27 g NaOH，定容至100 mL(B液) 。两者均置于4 ℃冰箱中。使用时，两者各取20 mL混合，定容至100 mL。 3,5-二硝基水杨酸：称取0.5 g 3,5-二硝基水杨酸，加20 mL 2 mol·L -1 NaOH

和50 mL H2O ，加30 g酒石酸钾纳，定容至100 mL(避光贮存) 。 1 mol·L -1 NaOH：称取40.01 g NaOH (G：40.01) ，定容至1 L。 2 mol·L -1 NaOH：称取80.02 g NaOH (G：40.01) ，定容至1 L。 α–萘胺试剂：称取0.2 g α–萘胺加25 mL冰醋酸，定容至100 mL。

对氨基苯磺酸：1 g 对氨基苯磺酸加热溶解后再加25 mL 浓HCl ，后定容至

100 mL。

Na 2HPO 4-柠檬酸缓冲液：

(1)0.2 mol Na2HPO 4·2H 2O 溶液：称取3.561 g Na2HPO 4·2H 2O ，定容至100 mL；