小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法

对这些弊端，在今后的研究中一方面必须考虑药物的理化性质和动物的生理生化参数对研究结果的影响，提高预测结果的代表性与准确性，另一方面必须提高检测技术的灵敏度，扩大生物标记选择的范围或降低对生物标记的要求。目前国际上有人提出生理药动学模型可以一定程度上解决以上问题，并已初步应用于食品动物的残留预测。

生理药动学模型（Ｐｈｙｓｉ０１０９ｉｃａｌｌｙＢａｓｅｄＰｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃＭｏｄｅｌ，ＰＢＰＫｍｏｄｅｌ）是根据生理、生化和解剖学的知识，模拟生物体循环系统的血液流向，利用血液将体内各个组织器官联系起来，按照物质平衡原则建立关系式，得到血液与组织以及各个组织之间药物浓度的相关关系。根据这些关系式，采集不同时间血样进行分析，就可以预测出组织中药物的残留量。近二十年来，ＰＢＰＫ模型在人医上应用较广泛，且主要应用于药毒物的危险性评估过程中，特别是通过ＰＢＰＫ模型预测药毒物在实验动物（大鼠）体内的分布与消除规律，利用ＰＢＰＫ模型的种属间外推特点，间接研究药毒物在人体内的处置过程，评价对人体的危害程度。ＰＢＰＫ模型在食品动物中的研究报道较少，早期主要用于鱼类药毒物危险性评估。ＰＢＰＫ第一次用于预测食品动物残留消除是在１９８４年，Ｄｕｄｄｙ等建立了磺胺噻唑在猪的生理模型，结果显示在除了脂肪外所有组织与试验数据都有很好的吻合，且比经典房室模型更准确的预测各组织中的药物浓度，提示ＰＢＰＫ模型应用于食品动物残留预测的可能。近年来，国外研究学者又陆续建立了土霉素在鲑鱼、牛和绵羊的生理药动学模型，以及磺胺二甲嘧啶在猪的生理药动学模型，充分揭示了ＰＢＰＫ模型预测食品动物组织残留及休药期的能力。

由于生理药动学模型的建立是在模拟药物在体内处置的基础之上，考虑到了药物的理化性质、机体的解剖生理参数、各组织器官的生理生化参数以及药物在机体内的动力学过程等因素，因此它建立的相关性能够从生理生化等理论上来进行解释，比传统的药动学模型更科学，对有效预测组织残留具有更大的准确性与指导意义，有望成为残留预测中一种新的技术手段。

小议在ＭＴＴ法测细胞增殖抑制率中ＩＣ５０的计算方法

赵斌，葛金芳，黄晓晖，李俊

（安徽医科大学药学院，合肥，２３００３２）

半数抑制浓度（５０％ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

Ｌｅｔｈａｌｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｉｃ５０）、半数致死量（ＭｅｄｉａｎＤｏｓａｇｅ，ＬＤ砷）、半数致死接触时问、半数有效量等反映药效或毒效的半数定量指标都建立在质反应（如动物的存亡、有效与否等定性反应）的量一效关系基础上的数据，其性质、特点、统计计算和数学规律均基本相同。１１５

ｌＩｃ５０的概念及含义

半数抑制浓度（Ｉｃ５０）是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在ＭＴＴ法中，就是以对照组吸光度ｏＤ值减少一半所需的药物浓度为ＩＣ５０。除此以外，半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值，作为反映药效的定量指标，在各种药物的筛选中广泛应用。该结论可由１９２６年Ｗｉｊｎｇａａｒｄｅｎ在５７３头家猫身上进行了洋地黄制剂的最小致死量实验中得出。

ＭＴＴ法检测药物影响细胞增殖的原理是只有存活的细胞能使外源性的ＭＴＴ还原为难溶的蓝色结晶物甲璜（ｆｏｒｍａｚａｎ）并沉积在细胞中，在二甲亚砜中溶解显色，而死细胞不能利用ＭＴＴ故不能显色。对每个细胞而言只有死亡与存活、

显色与不显色两种情况，与ＬＤ鼬计算中要求的质反应一致，并且符合常态分布，故可以应用计算ＬＤ∞的方法来求解ＩＣ∞，同样半数抑制浓度相当于药物对细胞的最小致死量的均值。而Ｉｃ５０、ＬＤ柏的测定比测定最小致死量要方便得多，其稳定性和准确性都比较好。所以，ＩＣ５０已成为标志药物效应的一种重要定量指标。

２ＩＣ５０的计算原理

为便于求解，这类质反应通过多次转变才可变为直线相关。具体如下：

①致死剂量的对数值与动物死亡率之间为常态累积曲线关系。每个动物的致死量与动物的个体差异有关，多数动物处于中等敏感的范围内。如果以致死量为横坐标，以动物死亡率为纵坐标，则可绘成一个钟形曲线，这一曲线与常态曲线不完全相同，其剂量大的一侧拖出长尾现象；

②将横坐标的剂量改为对数剂量，则曲线就化成为对称的常态曲线；

③剂量对数值与死亡率问为Ｓ型曲线，向心对称，对称中心纵坐标为５０＊／，死亡率，横坐标为ＬｏｇＩｃ５０。该曲线的两端平坦，中间陡斜，曲线中段死亡率在５０％附近的点比５％、９５％的点更为重要：

④剂量对数值与概率单位之间为直线关系。为了便于数学回归分析，需要将Ｓ型曲线转化为直线，引入。机率单位”（Ｐｒｏｂｉｔ）的概念，通过查表可将死亡率转化为。机率单位”．

所有不同的ＬＤ∞计算方法都是基于这些质反应的特点设计和推导的。通过以上的分析，我们可以知道药物浓度和抑制率并不呈明确的直线相关，而是药物抑制率的机率单位同药物浓度的对数值呈直线关系。有人通过仅仅以药物浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，作Ｘ、Ｙ的散点图，直线拟合，求得直线回归方程来计算Ｉｃ５０，我们认为这种方法不够严谨，理论依据不足，不完全符合计算原理，计算结果不可信。并且在实际应用中，往往很难作出一条满意的直线，相关系数太小，故不推荐采用。

３ＩＣ５０的计算方法及适用条件１１６

２．专题报衡及论文交流

计算Ｉｃ５０的方法多达几十余种，包括芷规机率单位法、点斜法、顾汉颐氏公式法、图解法、寇氏法、序贯法、Ｌｏｇｉｔ法等，近年来，又出现了上下移位法（ｕｐ－ａｎｄ－ｄｏｗｎ法）、固定粼量法（Ｆｉｘｅｄｄｏｓｅｐｒｅｃｅｄｕｒｅ）、评估法等疆朝，本文主要介绍几种精密度较好，有实际应用价值的方法。其他方法虽多，但无特殊优点。

３。１。正撬巍率单位法

Ｂｌｉｓｓ所创建，后为Ｆｉｓｈｅｒ等所发展的加权机率单位法，在数理上最为严谨精密，故称为枧率单位正趣法。其它许多方法虽然也称为机率单位法，僮有翦未计算投重。它有以下特点：作图估线、加权回归、作业校正、逐次逼近、全面检验。正规法可以算出Ｉ‰、ＩＣｌｏ等及其标准误、可信区阅等全面宥关数据，丽且可进行各种误差及精度检验。适用于任何实验设计，对符合常态分布原员｜ｊ麓实验，本法可作为标准方法。但其计算复杂，现在多采用统计软件求解，具体方法如下：

３．１。１。ＳＰＳＳ软件在王氛计算孛酶应焉

进入ＳＰＳＳ数据编辑器后，激活变量表（Ｖａｒｉａｂｌｅｖｉｅｗ）定义变量，在变量名（ｎａｍｅ）下，输入。剂爨”、搿撺铡率”、搿总值一，然后送入数据表（Ｄａｔａｖｉｅｗ），根据袭头提示，依次输入备组数据。选择参数ＡＩｌａｌｙｓｉｓ—ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ—ｐｒｏｂ－ｉｔ，调出搿Ｐｒｏｂｉｔ

ａｎａｌｙｓｉｓ”对话框，将搿剂量”选入搿Ｃｏｖａｒｉａｔｅｓ一栏中，搿抑制率舛选入搿Ｒｅｓｐｏｎｓｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙ”橙中，搿总值”选入搿Ｔｏｔａｌｏｂｓｅｒｖｅｄ”栏中，搿总值”多设为１００％，在。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ一栏中，选择搿Ｌｏｇｂａｓｅ１０”，在。Ｍｏｄｅｌ一栏中选择搿Ｐｒｏｂｉｔ”概率单位模

ｆｒｏｍ型，在。Ｏｐｔｉｏｎｓ”栏孛选择“ｃａｌｃｕｌａｔｅｄａｔａ”邸依据现有数量所褥酶在缺少裁激

条件下的响应率来估计自然响应率，其他保持默认选项，然后单谢。ｏＫ一即可。

完成上述操终，ＳＰＳＳ会鸯动照示全部分折结果（Ｓｐｓｓｖｉｅｗｅｒ），首先显示共有几缀数据进行了概率单位模型分析，回归方程经过几次叠代运算后确定，该方程拟合优度检验ｘ２值、Ｐ值（ｐ＞Ｏ．０５），说明曲线拟含良好。接着，系统显示刹量对数值（ｘ）、个体总数（ＮｕｍｂｅｒｏｆＳｕｂｊｅｃｔｓ）、观察判的反应数（ＯｂｓｅｒｖｅｄＲｅｓｐｏｎｓｅｓ）、预期反应数（Ｅｘｐｅｃｔｅｄ

Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、残差（Ｒｅｓｉｄｕａｌ）和效应的概率（Ｐｒｏｂ）之后，显示各效应概率水平的剂量霞（包括０。５０，即壬‰）及其９５篱可信区阕值，茨及对数单位与概率单位的关系瞳线圈。３．１．２．ＳＡＳ软件在Ｉｃ５０计算中的应用

露嚣谨界公认鹃专业统计软俦，其统计嚣序、统诗函数帮各种算法科学、严谨、精确，适用于不同领域的统计计算。运用ＳＡＳ软件进行生物梭定中ＬＤ∞的计算，直接利用原始试验数据，调用ＳＡＳ内部爵毁￡＆。￥８Ｓ，或编澍专门的程序，其算法科学合理，简便快速，结果糟确可靠，舆体见参考文献。

３．１。３．其他

应用Ｆｏｘｐｒ０２．５中的ＬＤ鞫计算函数，还可在Ｅｘｃｅｌｌ中调用张编辑器编写程序，以Ｂｌｉｓｓ算法为原理，利用现代高科技计算机技术求解Ｉ‰的值，具体见参考文献。１１７

３．２．点斜法

又名综合法、改良寇氏法，是我国孙瑞元教授提出的较实用的计算法，可以简捷地算褥与正规法搬当接近斡全韶王岛有关数据。其精确发优于其它备种篱佬法。该法适耀予：①剂量呈等比数列；②备组动物或细胞数基本相等，②死亡率、抑制率分布大致符合常态。采用Ｐｍ≠ｌｌ，Ｐ

点优于寇氏法。

基本公式：

①Ｉｃ５０：ＩＣｅ－－Ｌｏｇ～［Ｘｍ－－ｉ＊（Ｚｐ一０．５）＋ｉ／４幸（１一Ｐｍ—Ｐｎ）］

②禽Ｏ％及ｌ００％死亡率时的ＬＤ∞；ｎ≠０时艴校正法，死亡率白毋无论是否包摆ｅ％绫１００％，均酣算，这一

ＩＣ酗－－－－Ｌｏｇ一【‰一ｉ，（ｚｐ一０．５）】

式中Ｘｍ为最高死亡率Ｐｍ组的剂量对数值，ｉ为组距，Ｐｍ为最高死亡率，ＰＩＩ为最低死亡率，ｎ先冬缀缀内动物数。

３．３．图解法

”Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ等提如，设计搿机率单位—对数坐标纸”及一系列诺模圈，使直接爨解法可以算出Ｉ‰各有关数据。优点有：简便、灵活，剂量间不一定要求有等距或等比关系、有权重含意。但目测图解法在精密度上则受到一些损失，特别是有些实验数据由不同人来计算，可能褥戮不同的Ｉ岛值。

３．４．Ｉｃ５０参数的显著性检验

３。《。薹。掇合度检验：

．检验预期回归线与计算的回期线是否拟合，Ｂｌｉｓｓ法中Ｙ—ｙ，的差值不应超过Ｏ．２，否刚要进行再一轮计算，如差值均小于０．２，则可以为预期拟合合格，可以计算Ｉ岛及其有关数据。ＳＰＳＳ软件中采用拟合优度检验ｘ２值表示，并且求其Ｐ值（ｐ＞０．０５），以判断是否拟会良好，符合最小二乘原理。

３．４．２．回归照著性系数（ｇ）

ＩＣ５０计算中回归系数（ｂ）也有其标准误（Ｓｂ），Ｆｅｉｌｌｅｒ氏提出搿回归显著性系数（ｇ）一，ｇ是＆与回归系数乇耩率ｂ）醒毙值之磊数，当ｇ夺于０。１对，可略丽不计，如果ｇ大予Ｏ。重，则回归显著性系数的影响不容忽视，应当采用Ｆｅｉｌｌｅｒ校正式来计算更为精确的９５％可信限。

４Ｉｃ６０在ＭＴＴ法检测药物对培养细胞的增殖抑制作用中的特点及注意事项

４．１．ＭＴＴ法中计算Ｉ‰的特点

在用ＭＴＴ法测细胞增殖抑制帛时，常需计算药物的ＩＣ５０值，并通过Ｉ‰值的大小来判定药物作用的强弱和特异性，为药物筛选和临床研究提供依据。和ＬＤ∞计算不同的，ＭＴＴ法中王‰计算有其自身特点；①体辫实验寐体志安验影嚷因素不霹；③由整体动物模型变为细艟水平，更为精细；③样本数量变化大，每孔中的细胞数量可达到ｌ旷～１０５个，远大于每组１１８

动物数；④细胞数量通过显色反应由测得的ｏＤ值表示，并且由ｏＤ值来计算药物对细胞的抑制率．这是因为细胞数量和０Ｄ值大小在很大的范围（２００＂－＇５Ｘ１０５个）成确定的直线回归关系，可用ｏＤ值代表细胞数量，以０Ｄ值来计算药物对细胞增殖的抑制率。

４．２．注意事项

４．２．１．结果判断在实验结果中，可能会出现一些数据比较混乱，参差不齐，或是小剂量组抑制率反而高于大剂量组，或是各点连线呈现曲线关系，造成这种情况可能有以下几方面的原因：①加药前每孔中接种的细胞数量相差较大，人为影响对抑制率的计算。解决的办法我们认为在给每组接种细胞的同时，接种一孔作为对照，比较各组对照孔的０Ｄ值应无显著性差异；并且在横向分组时接种细胞的顺序应为纵向，以减少组间的细胞数差异；②可采用异质性检验，如异质性有显著意义。往往意味着实验数据不符合常态分布原理，应追查原因，重做实验。异质性数据可校正后计算ＩＣ，５０值，此时可信限范围格有所扩大；③若出现多组数据混乱，可在实验的同时做一条细胞数量的标准曲线验证，即细胞计数后倍比稀释接种培养板，温育后不加药物，直接通过ＭＴＴ法测吸光度，绘制０Ｄ值对细胞数量的回归线，正常应为直线关系，否则可能实验有错误，需重新实验；④药物对细胞的抑制作用有可能不成常态分布，已发现并经遗传药理学研究证明了某些药物的致死量并不符合常态曲线，如阿托品对家兔、异烟肼对大白鼠等；

其他①多种药物筛选比较时，可通过各药的Ｉｃ５０假设检验，明确药物作用效应的大小，比较两药Ｉｃ５０之间的差别有无显著意义，可用两组ｔ检验，但计算中不能直接计算Ｉｃ５０的差值，而应计算ＬｏｇＩｃ５０：②为了更全面地反映药物作用特征最好列出ＩＣ５０及９５％平均可信区间（Ｌ艏），并用括号附以ｂ值或ＩＣ－ｏ值；③实验时抑制率应超过５０％，保证量—效曲线跨越足够的范围，不可外推计算ＩＣ５０，④因为细胞体外用药是极其微量的，可以达到ｉ０‘薯ＭｏＬ／Ｌ，甚至更低，在应用软件求解时，可能会出现小数位数太多无法显示的情况，一方面可用科学计数法来表示，另一方面可以在计算把所有的药物浓度同时扩大１０５倍，求得Ｉｃ５０后再转化回来。１１９

小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法

作者：

作者单位：赵斌， 葛金芳， 黄晓晖， 李俊安徽医科大学药学院,合肥,230032

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引用本文格式：赵斌. 葛金芳. 黄晓晖. 李俊 小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法[会议论文] 2007