磷酸化蛋白质检测技术研究进展

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第２９卷第５期２００６年

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＶｏｌ．２９Ｎｏ．５２００６泸州医学院学报

磷酸化蛋白质检测技术研究进展

严冬梅综述，李

洪审校

６４６０００）

（泸州医学院生物化学教研室，四川泸州

中图分类号ＴＱ９３７

文献标识码Ａ

文章编号１０００－２６６９（２００６）５－０４６０－０２

检测。对于磷蛋白的检测则是用抗磷酸化抗体免疫检测分离抗酪氨酸磷酸的磷酸化蛋白质。ＯｔｔｏＨ等［２］利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、化特异抗体进行免疫印迹、胶内酶解以及质谱分析技术鉴定得到了８种与核膜相关的酪氨酸磷酸化蛋白质。真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇残基上，侧链羟基磷酸化抗丝、

较小，使得抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差［３］，所以很少被用来进行免疫印迹反应。抗酪氨酸磷酸化抗体特免疫印迹通常和免疫沉淀结合，因为异性较好，也最为常用［４］。

磷酸化蛋白质含量低，先用免疫沉淀将磷蛋白富集，可以降低非磷酸化蛋白的干扰。Ｇｒｏｎｂｏｒｇ等［５］对多种商品化的抗磷酸丝氨酸／苏氨酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价，发现有３种抗体可应用于免疫沉淀，并成功富集了磷酸酶抑制剂ｃａｌｙ－

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一，其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制。酶蛋白的磷酸化是在蛋白激酶的催化下，由

ＡＴＰ提供磷酸基及能量完成的，而去磷酸化则是由磷蛋白磷

酸酶催化的水解反应。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有

１／３的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有５％的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋

白激酶和磷酸（酯）酶［１］。真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发苏氨酸（Ｔｈｒ）和酪氨酸（Ｔｙｒ）残基侧链的羟基生在丝氨酸（Ｓｅｒ）、

上，不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，生物体内能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白质组（ｐｈｏｓ－

ｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ），磷酸化蛋白质组将是蛋白质翻译后修饰的研

究热点。

１［３２Ｐ］放射性标记

放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法，是在无磷培养基中培养细胞时将放射性同位素３２Ｐ标记到磷酸化蛋白质上，经一维或二维凝胶电泳进行分离，然后通过放射自显影来检测磷酸化蛋白质。这种方法具有直接、灵敏性高、相对价廉的特点，尤其是与双向凝胶电泳（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙ－

ｃｕｌｉｎＡ诱导的Ｈｅｌａ细胞磷酸化蛋白质。免疫印迹主要优点

是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较。但抗体并非绝对专一性，许多非磷酸化蛋白质会出现假阳性的结果，而且抗体价钱一般比较昂贵。

３．质谱技术鉴定磷酸化蛋白质

分子或分子碎质谱（ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＳ）是带电原子、

片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。用于分析蛋白质的质谱则是通过正确测定蛋白质分子的质量，来进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用等方面的研究。它是对分离的蛋白质进行鉴定的一种重要方法，也是蛋白质组研究中最关键的一步。生物质谱技术主要包括电喷雾质谱技术（ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚｓａｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＥＳＩ－ＭＳ）、基质辅助激光解吸附质谱技术（ＭａｔｒｉＸＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐ－

ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２－ＤＰＡＧＥ）结合后可以从蛋白

质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化。但这种方法只能对部分可以进行放射性标记的细胞进行检测，不能标记组织样本；同时需要大量的磷酸化蛋白质，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化／去磷酸化代谢速率不同，对某些磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质，可能检测不到；而且具有放射性污染，因而不能进行高通量分析，极大地限制了它的应用。

２免疫印迹技术

免疫印迹（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）又称蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ－该法是在ｔｉｎｇ），是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白（抗原）的样品首先用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）或非变性电泳（Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ）等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性：，，ｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＭＡＬＤＩ）、快原子轰击质谱技术（ＦａｓｔＡｔｏｍＢｏｍｅｂａｒｄ－ｍｅｎｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＦＡＢＭＳ）以及同位素质谱

等。ＤａｖｉｓＭＡ等

［６］

利用Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄｄｙｅ和ＭＡＬＤＩ－

ＴＯＦ－ＭＳ等技术相结合，用蛋白激酶抑制剂Ｈ８９作用小鼠

肝细胞，结果表明肝细胞磷酸化蛋白试验组和对照组有明显的区别。目前利用质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法，包括利用固定化的金属亲和层析柱、抗体和化学标签技术富集目的分子，肽片段质量图和前体离子扫描（ｐｒｅｃｕｓｏｒｉｏｎｓｃａｎｓ）等技术检测磷酸化肽段，串联质谱对磷酸化肽段测序鉴定磷酸化位点，以及引入质量标签对蛋白质的磷酸化水平进行定量等。

第５期严冬梅等：磷酸化蛋白质检测技术研究进展

学、生物医学、生物化学等学科的研究，特别是在蛋白质等生物大分子的研究中作用越来越重要，已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位［７］。质谱技术具有上述诸多优点，但主要针对单个蛋白质，不能很好的反映蛋白质组整体的变化。

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ｒｏｌｅｉｎｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＰｈｉｌｏｓＴｒａｎｓＲＳｏｃｌａｎｄＢＢｉｏ１Ｓｃｉ，１９９８，３５３（１３６８）：５８３

２．ＯｔｔｏＨ，ＤｒｅｇｅｒＭ，ＢｅｎｇｔｓｓｏｎＩ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｅｎｖｅｌｏｐｅ［Ｊ］．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，２００１；２６８（２）：４２０

３．ＫａｕｆｍａｎｎＨ，ＢａｉｌｅｙＪＥ，ＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ．Ｕｓｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｔｗｏ－ｄｉｍ－ｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００１；１（２）：１９４４．ＭａｇｕｉｒｅＰＢ，ＷｙｎｎｅＫＪ，ＨａｒｎｅｙＤＦ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅｐｒｏｔｅｏｍｅｆｒｏｍｔｈｒｏｍｂｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｐｌａ－ｔｅｌｅｔｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２；２（６）：６４２

５．ＧｒｏｎｂｏｒｇＭ，ＫｒｉｓｔｉａｍｅｎＴＺ，ＳｔｅｎｓｂａｌｌｅＡ，ｅｔａｌ．Ｍｏ１．Ｃｅｌ１［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００２；１（７）：５１７

６．ＤａｖｉｓＭＡ，ＨｉｎｅｒｆｅｌｄＤ，ＪｏｓｅｐｈＳ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒａｔｌｉｖｅｒｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎ－ａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒＨ８９（Ｎ－（２－［ｐ－ｂｒｏｍｏｃｉｎｎａｍｙｌａｍｉｎｏ－］ｅｔｈｙｌ）－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ，２００６；３１８（２）：５８９

７．成海平，钱小红．蛋白质组研究的技术体系及其进展［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２０００；２７：５８４

８．ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＴＨ，ＡｇｎｅｗＢＪ，ＧｅｅＫＲ，ｅｔａｌ．ＧｌｏｂａｌｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｔｅｃｈ－ｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００３；３（７）：１１２８

９．ＳｃｈｕｌｅｎｂｅｒｇＢ，ＰａｔｔｏｎＷＦ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃａｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｐｈａｓｅｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇｗｉｔｈＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｄｙｅｓｔａｉｎｉｎｇｔｏａｎａｌｙｚｅｐｒｏｔｅｉｎｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４；２５（１５）：２５３９

１０．ＧｏｏｄｍａｎＴ，ＳｃｈｕｌｅｎｂｅｒｇＢ，ＳｔｅｉｎｂｅｒｇＴＨ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓｏｎｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｍｅｍｂｒａｎｅｓｕｓｉｎｇａｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｏｒｇａｎｉｃｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００４；２５（１５）：２５３３

１１．ＡｇｒａｗａｌＧＫ，ＴｈｅｌｅｎＪＪ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｅｃｏｎｏ－ｍｉｃａｌｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｓｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔ－ｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５；５（１８）：４６８４

１２．ＳｔａｓｙｋＴ，ＭｏｒａｎｄｅｌｌＳ，ＢａｋｒｙＲ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｄｉｆ－ｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｔａｉｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００５；２６（１４）：２８５０

４磷酸化蛋白质的荧光检测

Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄｄｙｅ是ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ公司近年推出

的一种磷酸化蛋白质的荧光染料

［８］

。Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄｐｈｏｓ－

ｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｇｅｌｓｔａｉｎ是一项突破技术，能够直接对聚丙烯酰胺

凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或者苏氨酸残基上的磷酸选择性染色，可以反映磷酸化蛋白质组整体变化。对标准的ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶或者２－Ｄ胶进行简单固定、染色和脱色，方法简便、快捷。ＳｃｈｕｌｅｎｂｅｒｇＢ等［９］将血浆蛋白质经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳后应用Ｐｒｏ－Ｑ来进行磷蛋白、糖蛋白和总蛋白的染色，并成功地检测到血浆中已知的磷酸化蛋白质。蛋白质经转膜后同样可以进行染色，ＧｏｏｄｍａｎＴ等［１０］先通过电泳把蛋白分离后再经蛋白质印迹把蛋白转移到ＰＶＤＦ膜，再用Ｐｒｏ－Ｑ染色来检测磷蛋白，能够在短时间检测到。Ｐｒｏ－Ｑ

Ｄｉａｍｏｎｄｄｙｅ不需要放射性同位素或者特异性抗体，染色后

蛋白可以通过质谱进行精确的鉴定。Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄｄｙｅ作为一种新的磷蛋白荧光染液，具有上述诸多优点，但是价格不是很便宜。为了减少染液的消耗，有人证实可以通过稀释染液延长染色时间，同样可以得到较好的效果从而减少成本。ＡｇｒａｗａｌＧＫ

［１１］

证明稀释三倍的Ｐｒｏ－Ｑ与不稀释的具有同

样的灵敏度，不同的是在固定、染色和脱色过程中分别延长一小时、两小时和四个半小时。Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄｄｙｅ还可以定量检测磷酸化蛋白质，ＳｔａｓｙｋＴ［１２］建立了一种功能蛋白质组学实验，把双向电泳和电泳后Ｐｒｏ－Ｑ染色的方法相结合，对二向电泳的磷蛋白进行定量检测。他运用表皮生长因子（ＥＧＦ）刺激乳腺上皮细胞，内胚层部分经亚细胞分离后在内涵体中成功检测得到磷蛋白。还有很多实验室用Ｐｒｏ－ＱＤｉａｍｏｎｄ

ｄｙｅ进行染色，都得到了比较满意的结果。

总之，随着后基因时代的到来，针对蛋白质功能进行研究的功能性蛋白质组学（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）已成了该时代研究趋势。蛋白质的功能与其结构密切相关，其结构变化万千，决定了丰富多样的蛋白质。而蛋白质的结构与它的加工修饰是分不开的，酶蛋白的磷酸化修饰是酶的共价修饰中最常见的一种方式。所以磷蛋白的检测在蛋白质组学的研究中占有举足轻重的地位，而且在细胞和组织的线路调节中磷酸化蛋白质的系统性分析将推动后基因时代的研究。

参

考

文

献

１．ＨｕｎｔｅｒＴ．Ｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｏｎｔｙｒｏｓｉｎｅ：ｉｔｓ

（２００６－０５－２５收稿）