丝裂霉素C对膀胱肿瘤细胞株HSP70的诱导作用
【摘要】 目的 研究丝裂霉素C对膀胱肿瘤细胞株TBC�1 HSP70的诱导作用。方法 丝裂霉素C作用与TBC�1于2 h后,观察在不同时间点0、8、24、48、72 hTBC�1的HSP70的表达情况。结果 丝裂霉素C化疗TBC�1后不同时间点0、8、24、48、72 h的HSP70的表达OD值分别为0.306±0.005、0.255±0.009、0.203±0.018、0.237±0.029、0.239±0.020。正常TBC�1的HSP70表达OD值为0.247±0.022。结论 丝裂霉素C可以诱导膀胱肿瘤细胞株TBC�1 的HSP70的表达增高。� 【关键词】 膀胱肿瘤;丝裂霉素;热休克蛋白70 热休克蛋白 (heat shock protein,HSP)是机体受高温或其它因子强烈刺激(如感染、肿瘤、病毒、自身免疫病等)时,由热休克基因编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白,并能对抗更为严重的应激损伤;HSP广泛存在于原核和真核生物。由于HSP70在大多数生物中含量最多,正常细胞内水平较低,而在应激状念下升高较为明显,因而是HSP家族中研究最多的一个。它包括68、72、73、热休克同源(Heat shock Cognate,HSC)70、grq75、78、80、Bip等多种蛋白 。HSP 70及其部分相关基因,在人类定位于第6、14、21对等染色体上,具有“分子伴侣”的作用。� 近年的研究证明,肿瘤细胞表达的热休克蛋白70 具有良好的免疫原性和肿瘤特异性[1],具有内在免疫佐剂效应,能与多种肿瘤抗原肽结合,在体内诱导特异性主动免疫。本实验研究丝裂霉素C对膀胱肿瘤细胞株TBC�1 HSP70表达的诱导作用,了解其HSP表达的特点,以期为人膀胱癌的免疫治疗提供理论依据。� 1 材料和方法� 1.1 丝裂霉素C诱导膀胱肿瘤细胞株TBC�1的HSP70的表达 将膀胱肿瘤细胞株TBC�1消化,调整细胞浓度为1.0×106/L的细胞悬液,500 ul/孔接种于24孔板内,置37℃、5%CO�2饱和湿度下培养24 h,见TBC�1细胞贴壁。于24孔板孔内加入200 ug/ml丝裂霉素C500 ul,混匀,进行化疗,继续培养2 h后,PBS洗涤细胞数次,重新加入RPMI�1640培养基1000 ul,分别在丝裂霉素C作用TBC�1化疗后的不同时间点0、8、24、48、72 h取出盖玻片,S�P两步法行免疫细胞化学染色,一抗HSP70为单克隆抗体,DAB染色,苏木精复染。另取未经丝裂霉素处理的盖玻片做正常组。阳性对照:选取热处理的肺癌细胞株GLC�82阳性表达HSP70 ,阴性对照:以PBS缓冲液替代HSP70一抗。取正常组、0、8、24、48、72 h组免疫细胞化学染色结果行图象分析,每张玻片随机取4个视野,用图像分析仪测定各个样本的平均光密度值(OD值)。� 1.2 统计学方法 全部资料结果以(x±s)表示,采用单因素方差分析,使用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析。� 2 结果� 丝裂霉素C化疗TBC�1后不同时间点0、8、24、48、72 h的HSP70的表达OD值分别为0.306±0.005、0.255±0.009、0.203±0.018、0.237±0.029、0.239±0.020。正常TBC�1的HSP70表达OD值为0.247±0.022。 经方差齐性检验后做方差分析,F值为12.341,(P 3 讨论� 傅庆国[2]认为温热效应可提高癌细胞的异质性,促进肿瘤抗原(如热休克蛋白等)的表达,有利于免疫系统对癌细胞的识别和杀伤,益于进行免疫治疗。故本实验研究丝裂霉素诱导膀胱肿瘤细胞的HSP70表达变化。� HSP70属于HSP家族的一分子,是所有原核细胞和真核细胞在高温或应激情况下产生的一组非常保守的蛋白质分子家族,又称为“分子伴侣”。HSP70在组织细胞损伤的过程中表达增强,并对细胞具有保护作用,同时也能反映细胞损伤的程度。� 首先,它作为分子伴侣参与肿瘤细胞周期调控和表型改变,阻止细胞终末分化后凋亡 ,甚至可以保护肿瘤细胞免受抗癌药物、射线照射等因素诱发的凋亡,故HSP可能参与了肿瘤细胞耐药机制。其次,作为分子伴侣,HSP70通过与原癌基因和抑癌基 及其蛋白产物的相互作用调节肿瘤细胞的增殖。HSP70在许多肿瘤组织和细胞中表达增高,与肿瘤的恶性程度,预后不良密切相关。再次,HSP70作为“分子伴侣”,还可以提供结合蛋白,在机体的自身免疫、抗感染免疫,特别是抗肿瘤免疫中起重要作用。� 在免疫应答过程中,热休克蛋白( heat shock protein,HSP) 可引导与其形成复合物或融合蛋白的抗原性物质在抗原递呈细胞内经MHC I 类途径加工递呈,提供激活抗原特异性CTL 的信号[3] 。最近研究发现,热休克蛋白可作为内源性危险信号诱导天然和获得性免疫系统发生免疫应答而促进自身免疫反应的产生[4] 。资料显示丝裂霉素C100 ug/ml作用于膀胱肿瘤EJ细胞株24 h为最佳诱导凋亡的条件[5],而丝裂霉素C100 ug/ml作用2 h可以诱导肿瘤细胞的HSP70高表达,并有一定的变化规律[6]。HSP 的高表达可通过下列机制使肿瘤细胞易于受机体免疫系统的攻击,即肿瘤细胞表面表达HSP,可使其容易被机体免疫系统的NK识别[7]。本实验发现常规培养条件下膀胱肿瘤细胞株TBC�1呈HSP70弱表达,位于细胞浆,经丝裂霉素100 ug/ml化疗后,0 h点HSP70表达增强,由细胞浆移至细胞核,8 h点表达减弱,由细胞核移至细胞浆,24 h点表达最低HSP70。HSP70 的这种变化规律说明在细胞受到应激反应时表达增强,可能是通过下调细胞凋亡的相关基因、蛋白核蛋白酶活性(如SAPK/JNK和Caspases酶)起到拮抗凋亡的作用[8] 。HSP70 在很多恶性肿瘤组织细胞中均有较高的表达,肿瘤细胞中的HSP70 具有伴移抗原肽的功能,能够结合、处理肿瘤细胞表达的多肽类抗原,参与抗原的递呈及T 细胞的活化,诱导多个克隆的细胞毒T 淋巴细胞,产生对几乎所有肿瘤细胞(HSP70 来源的肿瘤组织) 的杀伤,克服了抗原调变致肿瘤免疫逃逸的缺陷[9]。� 热休克蛋白(HSP)具高度保守性,在不同生物种属中有70% 以上的同源结构,因而具有广泛的生物学意义。在免疫应答中HSP不仅能携带特异性肿瘤抗原,将其转交给MHC I、II类分子,还可作为抗原呈提分子直接将抗原肽呈提给T细胞,使其活化、增殖,发挥细胞毒和分泌细胞因子双重功能[10]。近年来还发现HSP70本身就可表达在细胞膜表面,把抗原直接呈递给T细胞,从而诱发宿主的抗肿瘤免疫。T细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤与肿瘤细胞HSP70的表达有关。HSP70可通过多种机制发挥其抗肿瘤活性。HSP70作为分子伴侣与肿瘤细胞内的内源性多肽结合,呈递给杀伤细胞介导抗肿瘤作用;通过激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(CD8+)杀伤肿瘤细胞;通过自然杀伤细胞(NK)发挥作用,同时激活辅助性T淋巴细胞释放细胞因子,经细胞免疫途径发挥抗肿瘤效应。HSP的高表达不仅参与肿瘤抗原的加工递呈,而且可作为抗原递呈分子直接将肿瘤抗原肽递呈给T细胞,激发T细胞介导的特异性抗肿瘤细胞免疫。用HSP70免疫小鼠后引起外周血中CD8+T细胞及Thl型细胞因子升高,肿瘤生长受到抑制,2周内肿瘤全部消退。� 本实验表明丝裂霉素C化疗TBC�1诱导HSP70的表达在0 h点表达最强,以细胞核为主,�24 h�表达最低,以细胞浆为主。由此推断用丝裂霉素C进行膀胱灌注,既可以发挥化疗药物的直接杀伤作用,又可以使肿瘤细胞的HSP70的表达增高,从而引发HSP70介导的抗肿瘤作用,达到抑制肿瘤的疗效,这尚需进一步的深入研究。 本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。