组织切片技术

组织切片技术

第一章 组织制片概述

组织制片技术是观察细胞、组织的生理和病理形态变化的一种主要的方法。组织化学技术和原位杂交技术都是以组织制片为基础的。

一、制片前的准备工作

1.染色缸和标本瓶的清洗

用毛刷沾去污粉将染色缸和标本瓶里外擦洗，自来水冲洗干净备用。金属银或组织化学染色时，器皿更要彻底清洗。先去污粉洗，再洗液浸泡过夜，再自来水和蒸馏水冲洗。

洗涤液的配制：重铬酸钾 300克 浓硫酸 300毫升 蒸馏水 3000毫升

2.载玻片和盖玻片及其清洗

载玻片简称为玻片或载片，一般尺寸为76毫米×26毫米，厚度为1-1.5毫米。

盖玻片一般为正方形或长方形，厚度为0.15-0.5毫米。最常用的规格为18×18毫米、20×20毫米，还有其它规格的。

煮沸洗涤法: 新旧玻片均可采用。洗衣粉水浸没玻片，加热煮沸15-20分钟，冷却，自来水冲洗，干净的白棉布或纱布擦干，保存备用。

酒精浸泡擦拭：新的玻片或载片可直接用酒精浸泡、擦拭，保存备用。

洗液浸泡法：要求严格的玻片，可在洗液浸泡后在冲洗干净。

二、制片方法的种类

（一）非切片法

不用切片机、没有切片手续而制成切片的方法。常用的有以下几种：

1.整体封藏法 待制作的材料一般很小或为一薄片状，如无脊椎动物的水螅和草履虫等，脊椎动物的鸡胚和蛙胚等。这些材料取下后经固定、脱水和染色就可以封藏在玻片内。

2.涂片法 主要是液体或半流动性的材料，如血液、精液、细胞学检查、微生物等，直接将材料涂在玻片上，再经固定和染色制成标本。

血液涂片的制作与染色：取一干净载玻片，用左手拇指和食指夹住，然后取一小滴动物血置于载玻片右端,再取另一张边缘光滑的载玻片, 斜置于血滴左侧, 先向右稍移动轻轻触及血滴,使血液沿玻片端展开成线状, 两玻片的角度以30~40°为宜(角度过大血膜较厚,角度小则血膜薄), 轻轻将载玻片向左推进,即涂成血液薄膜,推进时速度要一致,否则血膜成波浪形,厚薄不匀. 待涂片在空气中完全干燥后,将血涂片靠近中央部分的两边(与载玻片短边平行的边)用玻璃铅笔圈上并平放在染色架上进行染色。①滴加数滴瑞特氏-姬姆萨(Wright’s-Giemse)混合染液覆盖已圈血膜，同时记住滴数，染3-5分钟。②滴加等量的蒸馏水后稍加晃动玻片继续染色5-10分钟。③用蒸馏水或自来水冲去染液(注意还要直接冲洗已圈部位), 吸水纸吸干或凉干即可观察。

3.撕片法 疏松结缔组织和肠系膜等就是采用这种方法。

4.磨片法 主要用于含钙盐较多的坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿和骨。

5.撕碎法

6.压碎法

7.印片或触片法

（二）切片法

使用切片机切片而制成切片的方法。常用的有以下几种：.石蜡切片法、冰冻切片法、振动切片法、超薄切片法

第二章 石蜡切片技术

第一节 取材和固定

制作切片的第一步就是把动物杀死，取下需要制作切片的材料。动物杀死的方法很多。根据动物的大小、种类及观察目的而定。例如，青蛙和小鼠等较小的动物可用断头法。一些较大的动物如兔子和猫等可用空气栓塞法，从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。此种方法各脏器易瘀血。也可采用扑杀法。无论那种方法都应该使动物迅速死亡。

动物杀死后立即取材和固定，否则组织会因失水变形和发生死后变化。

一、取材

1.动物屠宰前应写好程序，准备好刀子、剪子、镊子、线、注射器、生理盐水、固定液等。固定液的量一般为材料的10---15倍或稍多。

2.取材注意事项 取材的刀、剪要锋利；动作要轻，不可来回切割，不要挤压组织以免损伤内部，先用镊子轻轻夹住，再用剪子或刀子切下，被镊子夹过的部分不要；柔软的组织可取稍大些，固定数小时后再切成小的组织块，继续固定；取材要快；切取的材料应根据需要观察的部位进行选择，考虑好切面的方向。

3.取材的顺序 先取容易自溶的组织，骨骼和肌肉后取，依次为心脏、肺、肝、脾、肾、小、大肠、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、脑垂体等。

取肠时可用生理盐水轻轻冲洗肠内容物，然后结扎一端，注入固定液，再结扎另一端，固定3—4小时后再切成小段。肺脏可用少量固定液自气管或支气管注入，约20分钟后略膨胀再切成薄片固定。

4.取材的大小 取材的大小一般为0.5×0.5×0.3厘米，1×1×0.3厘米，最厚不超过0.5厘米。

取材很关键，应新鲜、迅速。

二、固定

将取下的材料，立即投入固定剂内，借助药品的作用，使组织细胞的形态结构保存起来。

（一）固定的目的

1.防止组织的溶解和腐败。

2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶类等各种物质沉淀下来，保存组织细胞原有的结构。

3.固定剂兼有硬化作用，使组织硬化、增加硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。

（二）固定剂的种类

种类很多，一般分为单纯固定剂和混合固定剂。单纯固定剂是用一种药品作为固定剂的如乙醇、甲醛等，混合固定剂是用几种药品配合起来，可以使各自的优点相互补充。

1.单纯固定剂

1）乙醇---无色的液体，可以与水以任何比例混合。具有以下特点：

穿透速度快，与其他固定液混合使用时可以增加他们的穿透力。

酒精固定的组织硬化显著，体积收缩厉害，组织在高浓度酒精中滞留过久，会变脆，体积缩小原体积的20%左

右。通常用95%或100% 的酒精固定，但是不宜放置过久，一般保存在70%酒精。

酒精是一种还原剂，易被氧化成乙醛，再变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合。

酒精可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，前二者生成的沉淀不溶于水，后者所生的沉淀则溶于水，所以酒精固定

的标本对核的染色不良。

2）甲醛---是一种气体，一般市售的为37-40%的甲醛水溶液或者称福尔马林，易挥发，有强烈的刺激性气味。

福尔马林固定组织，渗透力强，组织收缩少，但经酒精脱水时收缩很大，它能使组织硬化并增加组织的弹性。

甲醛为非沉淀性固定剂，但是可与蛋白质化和，对脂肪、神经及髓鞘的固定效果较好，也可固定高尔基复合体和线粒体，为一般病理制片常用。固定后，核的染色较好，胞浆染色较差。

适合固定的浓度：10%的福尔马林。固定小块组织数小时即可，时间长也没有关系。加热可缩短固定时间。对

于较长时间固定的组织须流水冲洗24小时甚至48小时，否则会影响染色效果。因为福尔马林防止久，能产生三聚甲醛白色沉淀，在高温下可变回甲醛，甲醛易氧化，变成乙酸，使溶液变为酸性，增加标本的酸性，严重时影响核的染色。可用如下方法保持中性甲醛：

福尔马林 100毫升， 蒸馏水 900毫升， 一水磷酸二氢钠 4克， 磷酸氢二钠 6.5克

3）醋酸---17℃以下结冰，又称冰醋酸。此液能凝固细胞核中的蛋白质，适合染色质或染色体的固定，穿透力强，对于一般的组织块，只需固定1小时。

此液可使细胞膨胀，防止收缩；不能凝固细胞中的蛋白质，所以不会使组织硬化，常和酒精、福尔马林等容易引起组织变硬和收缩的液体混合。

4）苦味酸---是一种黄色结晶，在水中的溶解度为0.9-1.2%，在空气中能自燃，在封闭容器中能剧烈爆炸，故在实验室中常配成饱和水溶液保存。易溶于酒精、二甲苯、苯、水。

苦味酸可沉淀一切蛋白质，它对类脂物、碳水化合物无作用。此固定液对细胞收缩明显，收缩程度可达50%以上，但是不使组织变硬；穿透速度慢。经苦味酸固定的组织不用水洗，可直接用70%的酒精洗去黄色，即使留些颜色也无妨碍。固定时间不宜过久，否则影响苏木精碱性染料的染色。

2.混合固定剂

1）Bouin氏液： 苦味酸饱和水溶液 75毫升 福尔马林 25毫升 冰醋酸 5毫升。

是一种良好的固定剂，一般组织学和胚胎学的材料均可固定，该液渗透力强，固定均匀，组织收缩少，可把一般的微细结构显示出来。一般组织固定12-24小时，小块组织数小时。

2）Carnoy氏液： 纯酒精 60毫升 冰醋酸 10毫升 氯仿 30毫升。

此液穿透速度快，达快组织不超过3-4小时，小块组织20-40分钟，时间久了，会使组织膨胀并有硬化现象。多用于细胞学制片，固定染色体、中心体、有丝分裂相等；对外膜致密的组织特别适合，也适于腺体和淋巴组织。

第二节 洗涤和脱水

一、洗涤

材料从固定液中取出后，需要立即冲洗使其中含有的固定液全部除去。否则留在组织中的固定液，有的可妨碍染色，有的可以发生沉淀物或结晶影响观察，有的可继续发生作用，使材料变坏或使以后的处理发生困难。冲洗有一定的原则，视固定剂的种类而异：

1.含有苦味酸的固定液，如Bouin氏液，倒去固定液入70%的酒精更换数次即可脱水。如想除去苦味酸的黄色，可在70%的酒精中加入少量的氨水（数滴），且能中和苦味酸，更换数次新液。

2.福尔马林固定的组织，一般不需要冲洗，固定时间长久的标本一定要充分水洗，否则会影响染色，一般自来水冲洗12-24小时。

3.含有铬酸、重铬酸钾的固定剂，必须流水冲洗，冲洗时间与固定时间相同或多于固定时间。

4.如固定液中含有氯化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗后必须在70%的酒精中加碘去汞（一般为0.5%的碘酒精），去汞后再用5%的硫代硫酸钠去除碘的黄色。因为汞易在组织内形成结晶不利于切片，不利于观察。

5.锇酸及含有锇算的固定液，必须用流水冲洗。因为锇算能使组织发黑，影响染色，经过酒精时形成沉淀。

6.用酒精或酒精混合液固定的组织，一般不要求冲洗，若冲洗，酒精浓度应与固定液酒精浓度相同，不可用水冲洗。

二、脱水

（一）脱水的目的和重要性

组织冲洗完毕后进一步就是脱水。因为组织经固定和洗涤后含有多量水分，因为水分不能和石蜡或火棉胶等支持剂混合，组织内有极少量的水分存在，就会妨碍这些支持剂的渗入，所以必须把组织中的水分彻底去除，这一步骤称为脱水。

脱水的作用：有利于组织的透明和透蜡。因为透明剂（二甲苯、氯仿）必须在组织完全无水的情况下才能渗入；水不能与包埋剂混合。脱水有利于组织的永久保存，水的存在能使组织分解。这是制片中相当重要的一个步骤，如果这一步骤没有掌握好，脱水不彻底，就会影响到组织的透明和透蜡，即使包埋好的材料也切不出好的切片，浪费材料和时间。

（二）脱水剂和方法

脱水剂必须在任何比例下与水都能混合，主要有两种类型：

1.非石蜡溶剂的脱水剂 如酒精、丙酮等，组织在脱水后必须经二甲苯透明才可浸蜡。

1）乙醇---常用的脱水剂，价格低廉，方法容易掌握。但是能收缩和硬化组织，还必须透明后才能透蜡。 脱水方法：一般组织可从70%酒精开始，经过80% 、90%、95%、100%酒精，使其逐步脱水。对一些柔软的组织如胚胎需 从20% 、30%或50%开始，否则组织收缩较大。

脱水的时间根据组织块的种类、体积大小而定。高浓度酒精一般不超过2小时，最长不超过3-4小时。 脱水必须干净，在换入高一级的酒精时，要先在吸水纸上吸干以免把水分带入高一级的酒精中，夹持组织动作要轻，不要损坏组织。

2）丙酮---可代替酒精做脱水剂，作用和酒精相似。脱水能力比酒精强，但组织收缩较大，多用于快速脱水或固定兼有脱水的方法中。

2.脱水兼石蜡溶剂的脱水剂 如正丁醇、叔丁醇等，组织在脱水后可直接透蜡，不需要中间二甲苯透明的步骤。

1）.正丁醇---黄色液体，易挥发，吸入后发生头痛，脱水能力弱，但收缩小，可与水和酒精混合，能溶解石蜡，可不经过透明直接浸蜡。

脱水程序是：经过各级酒精，换入正丁醇，在换一次新正丁醇，最后入正丁醇石蜡中。

2）叔丁醇---无毒，可与水、酒精、二甲苯混合，是一种很好的脱水剂，此液不会使组织收缩或变硬，不必经过透明，直接浸蜡。

第三节 透明

组织在脱水后，所用的大多数脱水剂不能和石蜡相混合，透明剂既可以与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁的作用。它可以提出脱水剂，在代替脱水剂后导致石蜡的渗入。

当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。如果组织不能透明，表明脱水未尽，必须重新返工，否则影响透蜡的进行。

在制片过程中，有两次透明。第一次是脱水后、透蜡前组织块的透明，目的是便于透蜡包埋。

第二次透明是染色后切片的透明，目的是利于光线的透过便于显微镜的观察。

常用的透明剂 最常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、石炭酸等。

二甲苯---应用最广的一种透明剂，价格便宜。五色透明，易挥发，易溶于酒精又能溶解石蜡，能与封片剂树胶

混合，不能与水混合。透明力强，作用较快，缺点是容易使组织收缩变硬变脆。所以组织不能在内停留过久，而且必须在完全脱水后才能应用。通常在制片进入二甲苯以前先经过1：1的酒精和二甲苯混合液，避免材料收缩。

氯仿---组织在其中浸存较久，收缩不厉害，也不会变脆；极易挥发，在透蜡时，浸入材料中的氯仿比二甲苯容

易挥发。缺点是渗透力弱，透明时间是二甲苯的2-3倍。

苯---近似二甲苯，挥发较快。对组织收缩较少，久浸组织也不会产生变硬变脆现象。

第四节 透入和包埋

组织经过脱水、透明后要让石蜡等支持剂透入内部使组织变硬并将组织包埋进去，以利于切片和观察，这个过程称为透入和包埋。

目的是除去组织中的透明剂，使石蜡渗入组织内部后把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成薄片。

一、石蜡的透入

石蜡是从石油中分离出来的一种甲烷系固体碳化氢。根据熔点的不同有软蜡和硬蜡之分。软蜡熔点低，一般切片所用的软蜡熔点为42-45 ℃、45-50 ℃。硬蜡熔点高，切片所用硬蜡熔点为52-54℃或56-60℃。选用石蜡的熔点应根据切片时的室温条件和组织类型来考虑。一般，石蜡硬度与组织硬度相近，组织较硬时用硬的石蜡；室温高时用硬蜡，室温低时用软蜡。石蜡太硬，切片容易切碎，石蜡太软，蜡带容易皱缩，很难展平。

配制和使用新蜡时必须经久煮练，因为新蜡内往往含有气体或水分，需要加热再溶化，反复加热以除去蜡内气体，增加石蜡密度。用过的废蜡 加热过滤后仍可使用，比新蜡更好用。

透入过程：当组织块在透明剂中透明好以后，就让石蜡渗入组织内部。先将组织块放入石蜡和二甲苯的等量混合液中，这样可减少组织的收缩和扭转，使石蜡随着透明剂渗入到组织的每个部分。从石蜡与二甲苯的混合液中取出组织块，必须经过纯石蜡Ⅰ、纯石蜡Ⅱ和纯石蜡Ⅲ，在每个蜡中的时间一般为半小时左右。根据蜡块的大小可适当变化时间，使石蜡中含有的剩余透明剂完全去除，以免影响切片。

二 、石蜡包埋

准备好石蜡包埋框或包埋盒、冷水、镊子等。

第五节 切片、贴片和烤片

一、切片

石蜡切片机

一次性刀片

磨刀

修快、粘在木块上，准备好毛笔、成蜡带的硬纸板，光滑面是反面应朝下放，有皱纹面是正面朝上。

切片中可能出现的各种问题：

1 切片分离不能形成蜡带：室温过低或石蜡过硬，蜡边过小或不平。

2 蜡带弯曲：蜡块上下面不平行，刀钝、蜡块不与刀刃平行等。

3 蜡片上卷，切过刀口致破裂：刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬。

4 蜡片易粘在切片刀上或切片太皱：室温太高或石蜡太软；刀片角度过小也能使切片皱缩。

5 切片厚薄不一； 刀或蜡块未固定紧，切片机磨损或有故障。

6 切片出现裂隙或碎裂：组织浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久，组织已经发脆，无法补救。 7 切片出现纵口：刀有缺口或石蜡内有硬的物质、刀口不清洁等。

8 切片时有沙沙声，切片有小孔：组织在透蜡时温度过高，组织受损，无法补救。

9 切成之片，组织自动脱落或与石蜡分离：透蜡不足。

二、贴片与烤片

1 展片---温水捞取法

展片烤片机或简易的方法，以器皿成温水，约40℃左右，将预先割开的蜡片摊于水面上，蜡片受热自然张开浮游在水面上。把玻片伸入水中将已经展开的蜡片移致玻片上，拨正位置，37℃烤干，约6-12小时即可染色。 2 捞片前玻片的处理---粘片剂

蛋白甘油、铬明矾-明胶、市售的各种粘片剂等

第六节 染色

根据不同的目的，选取不同的染色方法，如组织化学方法、免疫组织化学方法、细胞组织的特殊染色方法等。介绍最常用的苏木精-伊红染色法

染色步骤

1.脱蜡： 把已经干燥的切片放入二甲苯中约10-15分钟。可以脱蜡2次，各5-10分钟。

2.入1/2二甲苯与1/2纯酒精的混合液中3-5分钟。此步骤可省略。

3.依次入不同浓度的酒精复水。100% 2分钟、95% 1-2分钟、80%1-2分钟、70%

4.入蒸馏水1-3分钟。

5.入苏木精染色10-15分钟。

6.入自来水中使颜色发蓝或流水冲洗5分钟或更长，流水不能过大。

7.蒸馏水洗1分钟

8.入酸性水分化 0.5%的盐酸酒精（70%酒精）。几秒或几十秒，为染色成败的关键。

9.蒸馏水洗1分钟

10.入碱性水复蓝3-5分钟。核呈蓝色，其他结构无色。

11.蒸馏水洗1分钟

12.脱水。70%、80% 、90%酒精各1-2分钟。

13. 95%的伊红酒精溶液5-10分钟

14.95%酒精去除多余的颜色，1分钟；100%酒精两次，各3-5分钟。

15.二甲苯酒精混合液，纯二甲苯两次各5-10分钟。

16.树胶封片。

组织切片程序时间表

取材、固定 12-24小时

水洗（可省略） 12-24小时

脱水 70%酒精 2小时或稍长

80%酒精 2小时或稍长

90%酒精 2小时

95%酒精 2小时

100%酒精 1小时

100%酒精 1小时

等比例二甲苯和酒精（可省略） 0.5小时

透明 二甲苯2次 各10-20分钟

透蜡2次 各20-30分钟

包埋

切片

贴片和烤片

染色