变性聚丙烯酰胺凝胶制备体会_李霞斌

　西南军医2010年5月　第12卷　第3期　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＳｕｒｇｅｏｎｉｎＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ,Ｖｏｌ.12,Ｎｏ.3,Ｍａｙ,2010　

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良反应,可能与本文病例中位于皮肤娇嫩部位少(仅1例额部、3例耳部患者)且所有病例疗程均较短(仅两周)有关。本文虽未进行对照研究,但治疗后痊愈率和总有效率与颜艳等[5]及霍晶[6]的研究基本一致。笔者认为复方氟米松软膏治疗慢性湿疹安全、可靠。【参考文献】

[1]　赵　辩.临床皮肤病学[Ｍ].第3版.南京:江苏科学技术出版

社,2001:604-606.

[2]　孙建方,郑志忠,顾　军,等.0.05%地奈德乳膏治疗湿疹的多中

心随机双盲、对照研究[Ｊ].中华皮肤科杂志,2006,39(1):26-

29.

[3]　毕志刚,田美华,林　麟.湿疹与特应性皮炎皮损处细菌学研究

.中华皮肤科杂志,2004,37:595-597.

[4]　陈小红,彭世瑜.水杨酸在银屑病治疗中的作用.国外医学皮肤

性病学分册,2000,26(3):172-175.

[5]　颜　艳,鞠　梅,于建斌,等.复方氟米松软膏治疗湿疹皮炎类皮

肤病临床疗效观察[Ｊ].中华皮肤科杂志,2006,39(2):116-117.

[6]　霍　晶.复方氟米松软膏治疗慢性湿疹疗效观察[Ｊ].实用医技

杂志,2007,14(27):3754-3755.

(收稿日期:2010-02-05　修回日期:2010-03-12)

变性聚丙烯酰胺凝胶制备体会

李霞斌,孙兴旺

　　[关键词]　变性聚丙烯酰胺凝胶;垂直电泳分离;制备体会

　　　　　　　[中图分类号]　Ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　692　　　　　　　　　[文献标识码]　Ｂ[文章编号]　1672-7193(2010)03-0483-01　　　　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用技术之一,凝胶的灌制比水平电泳槽凝胶灌制困难,漏胶和产生气泡常在所难免,需经过反复实践才能掌握其灌制技巧。我们在用ｍＲＮＡ差异显示技术筛选成人难治性肾病与激素敏感性肾病综合征患者间差异基因的实验中,运用变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离ＰＣＲ产物条带,硝酸银染色显示条带进而筛选两者间差异基因。现结合相关参考文献[1-2]就凝胶制备的体会报道如下。

Ｄｏｉ:10.3969/ｊ.ｉｓｓｎ.1672-7193.2010.03.040

生渗漏。用琼脂糖封边的不便之处为:一般变性聚丙烯酰胺凝胶面积较大,厚度常不到1ｍｍ,在灌制中如果有极小的琼脂糖液滴不能流到底部,在聚丙烯酰胺凝胶灌注时会在残留的琼脂糖附近产生气泡;琼脂糖浓度偏低则凝聚时间长,延长灌胶时间,且灌制琼脂糖时也要发生漏胶。我们参照《分子克隆实验指南》[1]的第三种方法:在胶室底部插入间隔片。选择稍长于玻璃板宽度的间隔片,仅需插入1ｍｍ即可,紧密对齐两边的间隔片,用弹簧夹夹住。此法仅需35ｍｌ胶液就能灌制47ｃｍ×17ｃｍ×0.04ｃｍ大小凝胶,渗漏很少。凝胶凝聚后取出底部间

隔片,用移液器吸取200ｕｌ左右电泳液沿玻璃板边缘充满底部间隙,不能留有空泡,否则电泳时凝胶下端电泳泳道会歪斜。使用该方法节约试剂,减少剩余胶液污染,操作简便快捷。

1　胶板准备

(1)胶板的清洁是灌胶能否成功的第一关键步骤。反复使

用时要将玻璃板和间隔片上凝胶去除干净,彻底洗净后干燥。用乙醇擦拭玻璃板上残留水渍。不能有一点残留的凝胶和残渣,否则灌胶时会产生气泡。(2)灌胶前要对玻璃板分别进行处理。长玻璃用亲和硅烷,短玻璃用剥离硅烷处理,便于电泳结束后长短玻璃板的分离,凝胶都粘附在长玻璃板上。处理时先用剥离硅烷涂抹短玻璃,再用亲和硅烷涂抹长玻璃,能不更换手套就避免亲和硅烷污染短玻璃。玻璃板上不能有多余硅烷,否则干燥后会留下水印,在后续实验如硝酸银染色显示条带时会有水印痕迹,影响显色条带的观察。可用镜头纸拭去多余硅烷。涂抹均匀后分开放置干燥玻璃,最好干燥过夜,否则会粘胶。

3　凝胶灌制

采用回流灌注法灌注凝胶。因制备好的胶室有弹簧夹,将胶室放置在一水平支架上。一人操作时以靠近操作者一侧胶室底角为最低点,左手托住对侧玻璃板中部抬高胶室约30°。右手从低侧短玻璃处缓缓灌注胶液成连续的细流,到达底部后逐步放低胶室,直至灌满,水平放置后插入梳子,6%凝胶聚合常需1～2小时。灌胶中如有气泡形成,调整胶室角度消除气泡后稍放缓灌胶速度常能凑效。【参考文献】

[1]　Ｊ.萨姆布鲁克,Ｄ.Ｗ拉塞尔.分子克隆实验指南[Ｍ].第3版.北

京:科学出版社,2002:1039-1041.

[2]　黄尚志,李　辉.垂直电泳槽凝胶水平灌制法[Ｊ].中华医学遗传

学杂志,1995,12(3):179.

(收稿日期:2009-12-14)

2　胶室制备

　　在凝胶灌制中胶室底部漏胶不可避免,需要准备较多的胶液以防漏胶过多而灌胶不足。胶室的制备对漏胶多少极为重要。一般胶室玻璃板间两边放置有间隔片而底部无间隔片,而

底部是最容易发生漏胶的地方。为防止漏胶常用方法有用胶布封边或用琼脂糖凝胶封底。用胶布封边时胶布一遇水就失去粘性,特别是在玻璃板的两个底角,常封固不牢而很容易发

作者单位:646000四川泸州,泸州医学院病理学教研室(李霞斌、孙兴旺)