大肠杆菌生长温度_膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系
45卷 3期2005年6月
微生物学报
ActaMicrobiologicaSinica
Vol.45No.3
June2005
大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系
李宗军
(湖南农业大学食品科技学院 长沙 410128)
摘 要:通过对大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间关系研究发现,10℃培养,对数期细胞有最大的压力抗性,随着培养温度的升高直到45℃,压力抗性呈下降的趋势;相反,10℃培养,稳定期的细胞对压力最敏感,随着培养温度的升高,压力抗性呈增加趋势,30～37℃时达到最大,之后到45℃有下降。对数期和稳定期细胞膜脂中不饱和脂肪酸的组成随温度的上升而下降,这与从全细胞中抽提的磷脂的熔点密切相关。因此,对数期细胞压力抗性随着膜流动性的增大而升高;但稳定期细胞,膜流动性与压力抗性之间不存在简单的对应变化关系。关键词:温度,高静压力,脂肪酸,大肠杆菌
中图分类号:Q935 文献标识码:A 文章编号:000126209(2005)0320426205
高压处理对微生物的细胞结构,包括核糖体、核
酸、酶、和细胞膜等产生影响,但对微生物的失活机理一直没有完全清楚的认识,通常认为细胞膜的破
[1～3]
坏是微生物致死的重要因素之一。压力处理导致细胞膜生理特性的变化,主要表现是ATP外吸收材料的泄露,以及荧光收加[4,5]等。
铰链,;膜蛋白也可能出现移
[6]
位,并发生构象的变化。不同温度条件下,微生物细胞膜的脂肪酸组成和膜的状态可能不一样,压力引起的膜的生理变化也存在差异,因此微生物的压力抗性也可能不同。本实验的目的就是研究不同的生长温度下,对数期和稳定期的大肠杆菌细胞膜的脂肪酸组成、膜的流动性和微生物压力抗性之间的关系。
蒙古包头市五十二所研制,压力范围0～800MPa,压力介质为癸二酸二辛脂;6820型气相色谱仪,美国。,以混菌方式准备营养肉汤平板,37℃培养48h。所有实验至少重复两遍。1.3 高压处理
将微生物全培养物115mL加入到215cm×215cm的塑料管中,热封口后进行压力处理,除实验)。设计需要外,所有压力处理都在室温下进行(25℃
温度补偿由压力斧外的水浴套层进行调节。1.4 脂肪酸的提取和分析
(10±(20±(30±(37±1)℃、1)℃、1)℃、1)℃
和(45±1)℃培养的对数期及稳定期的细胞悬液,4℃离心收集菌体,用磷酸盐缓冲溶液洗涤两遍,冷
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和培养:大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC80739,购自中国科学院微生物研究所。大肠
冻干燥备用。脂肪酸的提取按文献[7]进行。用气相色谱进行分析,条件为:进样口温度:250℃;检测器温度:260℃;载气:氮气;载气流速:112mLΠmin;分流流速:22mLΠmin;分流比:20:1;尾吹气:氢气,32mLΠmin;程序升温:初温80℃,20℃Πmin升到210℃,再以3℃Πmin升到225℃,保持12min。115 差示扫描量热计分析脂类的物理状态
杆菌在营养肉汤中振荡培养活化后,用稳定期细胞
按011%(VΠV)的接种量,在特定温度下培养,备用。对数期细胞为37℃培养,680nm最适密度OD值为012;稳定期细胞为接种后37℃,18h后的培养物。1.1.2 主要试剂和仪器:营养肉汤培养基(购自Sigma公司),其它化学试剂为分析纯。高压设备,内
取稳定期细胞培养液500mL,2500×g,4℃,离心15min收集菌体,用含10mmolΠLMgCl2250mmolΠLTris的缓冲液(pH715)洗涤两遍。沉淀重新悬浮在
作者简介:李宗军(1967-),男,湖南临湘人,副教授,博士,研究方向是食品微生物与生物技术。Tel:86-731-4617007;Fax:86-731-4617013;
E-mail:[email protected]
收稿日期:2004-09-27;修回日期:2005-01-22
3期李宗军:大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系427
7mL上述缓冲溶液中,加入20mL甲醇和10mL氯
仿;连续振荡30min;再加入10mL氯仿和10mL缓冲溶液,连续振荡2h。静置,溶液分为两相,收集下层
μ的氯仿层,挥发溶剂。用超声波按1mgΠ10L的比率将样品分散在含有10mmolΠLMgCl2250mmolΠLTris缓μ冲液(pH715)中。取2L样品加入到差示扫描量热
计的样品盘中,-20℃,30min处理后转入到Perkin-ElmerDifferentialScanningCalorimeter(DSC-7)型量热计中。分析采用10℃Πmin的温度梯度在-10～60℃的范围内进行,以空白作为对照。
2 结果和分析
2.1 生长温度与压力抗性
图2 生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响
Fig.2 EffectofgrowthtemperatureonpressureresistanceofE.coli.),20℃(),30℃(□),37℃(△),E.coliweregrownat10℃(◆
)toand(A)ortostationary45℃(◇
andat(.cellsaftertreatment;N0ofcells.
生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响如图1所示。压力抗性以一定时间(5min)内压力处理前后大肠杆菌菌落数比值的对数表示。10℃培养的大肠杆菌对数期细胞有最大的压力抗性,但随着温度的连续升高直到45℃,趋势(图1-A);相反,10℃最敏感,,增大,到30,45℃时,压力抗性下降(图),以用一定压力下,不同处理时间内大肠杆菌的存活率来描述(图2)。大肠杆菌压力失活动力学一般不呈线性关系,初步的结论是大肠杆菌对数期细胞与稳定期细胞具有不同的压力抗性
。
2.在对数期和稳定期的细胞中,随着生长温度的升高,细胞膜中饱和脂肪酸的比例增加,不饱和脂肪酸的比例下降(表1,表2)。稳定期细胞中不饱和脂肪酸的含量下降,而环丙烷型脂肪酸的含量增加,在30℃培养的稳定期细胞中达到最高水平为2914%。
流动指数(FluidityIndex,FI)以不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值来计算。在计算流动指数时将短链脂肪酸排除在外,因为研究发现这些脂肪酸主要存在与细胞膜外层的脂类中,对细胞膜的流动性影响不大。虽然对数期细胞的细胞膜的流动指数高于稳定期,但两个时期的流动指数与生长温度之间呈线性负相关(图3),回归方程分别是:对数期,FI=
2
-01068・Tg+4106(R=01987);稳定期,FI=2-01068・Tg+3160(R=01966),Tg为生长温度。
表1 不同生长温度下对数期大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成
Table1 FattyacidcompositionofexponentialphasecellsofE.coli
grownatdifferenttemperatures
Fattyacid
10℃
Perfattyacidoftotalcomposition
atdifferenttemperaturesΠ%20℃[***********]19
271030℃[1**********]19
37℃510617013
[1**********]910
[1**********]112
[1**********]45℃319619
110417
图1 生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响
Fig.1 EffectofgrowthtemperatureonpressureresistanceofE.coli),20℃(▲),30℃(□),37℃(△),E.coliweregrownat10℃(◆
)toexponentialphase(A)orstationaryphase(B)andtreatedfor45℃(◇
5minatdifferentpressures.Ni:Numberofcellsaftertreatment;N0:Ini2tialnumberof
cells.
12:014:015:014:0-3OH16:1ω7c16:1ω5c16:0
428续表1
Fattyacid
10℃
17:0(cyclo)17:018:2ω6,9c18:1ω9c18:1ω7c18:1ω6c18:0UFAaSFAFI
d
ebc
微 生 物 学 报45卷
Perfattyacidoftotalcomposition
atdifferenttemperaturesΠ%20℃014012
[***********]0133141216
[***********]0142181414
[***********][1**********]0℃015
37℃[***********][***********]9
[***********][1**********]5℃110
013
图3 生长温度与对数期、稳定期细胞膜流动性指数的回归直线
Fig.3 RelationshipbetweengrowntemperatureandthemembraneFIof)orstationaryphase(○)exponentialphase(●
CFA
a:UFA(unsaturatedfattyacid),totalof16:1and18:1;b:SFA(saturated
fattyacid),totalof16:0and18:0;c:CFA(cycloproponefattyacid);d:FI(fluidityindex),viz.(UFA+CFA)ΠSFA;e:SCFA(short-chainfattyac2id),totalof12:0and14:0.
表2 不同生长温度下稳定期大肠杆菌细胞膜脂肪酸组成
Table2 FattyacidcompositionofstationaryphasecellsofE.coli
grownatdifferenttemperatures
Fattyacid
12:013:014:013:0-3OH15:014:0-3OH16:1ω9c16:1ω7c16:1ω5c16:017:1ω7c17:0cyclo17:018:1ω7c16:1ω6c18:0
18:1ω7c,11methyl19:0iso19:0cycloUFAaSFAbCFAcFIde
脂溶解特性之间的关系,从不同培养温度条件下的
稳定期细胞中提取总磷脂,
,。差示扫描量:2个宽的不对(对应的峰与冰的溶解相关;另一个,最高峰对应的温度即为磷脂的熔点(Tm);对称峰对应的是磷脂的相变温度,此时磷脂中含有50%的液晶态。峰下对应的面积即为磷脂熔化所需的能量,能量的大小受相变分子的数量、分子的同质性及水化程度的影响;经测定熔点温度与生长温度呈正相关,与流动性指数呈负相关(表3)。
Perfattyacidoftotalcomat%
014
[***********][***********]
[***********][***********][**************]
[***********]516
[***********]11912
[***********]1711
[***********][1**********]16
[***********]172512017
410
112
119
2914
2211
1911
3416211
1180123815
4217218
017512
016718
016813
1011
1119
1118
30417
317
45318
图4 全细胞脂类提取物的差示扫描量热测定图谱
Fig.4 DSCgraphforlipidsextractedfromwholecellscellsgrownat20℃(A)or37℃(B)toexponentialphase
表3 稳定期细胞中磷脂的熔点温度、流动性指数与
生长温度之间的关系
Table3 Relationshipamongphasetransitiontemperature(Tm)of
phospholipids,FIandgrowntemperature
GrowntemperatureΠ℃
1020303745
Tma:UFA(unsaturatedfattyacid),totalof16:1and18:1;b:SFA(saturated
fattyacid),totalof
16:0and18:0;c:CFA(cycloproponefattyacid);d:FI(fluidityindex),viz.(UFA+CFA)ΠSFA;e:SCFA(short-chainfattyacid),totalof12:0and14:0.
3123±01892111±01431147±01230194±01330178±0102
12111±112121178±017431122±013437134±113243167±0121
2.3 膜的流动性与压力抗性之间的关系
为了明晰大肠杆菌生长温度、流动性指数和膜
3期李宗军:大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间的关系429
假设在一定温度下,膜的流动性与磷脂的熔点线性相关,如熔点越低,膜的流动性越大;那么对数期细胞中膜的流动性越大,压力抗性越强;而稳定期细胞则具有更为复杂的关系,生长温度在10～37℃之间,膜的流动性与细胞压力抗性间是负相关关系,即细胞膜的刚性越大,压力抗性越强,生长温度在45℃,这种趋势刚好相反,即膜的刚性增加,压力抗性下降。
3 讨论
3.1 生长温度对细胞膜脂肪酸组成的影响
大肠杆菌生长在不同的温度条件下,细胞膜的脂肪酸组成是不一样的,随着生长温度的降低,细胞膜中不饱和脂肪酸的含量增加,而饱和脂肪酸的含量下降,这与有关文献的报道一致。不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸的熔点低,不饱和脂肪酸含量增加会导致细胞膜相变温度的下降,生长温度的不同引起的细胞膜脂肪酸组成的变化,生命活动对膜流动性的要求。
[11]
,微生物,证明不,也说明用实验中定义的流动性指数来指示膜的流动性是可行的。3.2 生长温度对压力抗性的影响
[8～10]
生长温度对大肠杆菌压力抗性的影响,对数期和稳定期细胞具有不同的表现。对数期细胞,随着生长温度的升高,压力抗性下降,这与文献[12]的结果一致,即10℃培养条件下植物乳杆菌对数期细胞的压力抗性大于30℃培养的对数期细胞;但稳定期细胞的压力抗性在30℃,37℃时达到最高,之后有所下降,这种结果在以前的文献中还未见报道。
稳定期细胞比对数期细胞有更高的压力抗性。对数期与稳定期细胞对压力抗性的不同取决于生长
)温度的变化。在大肠杆菌的最适生长温度(37℃下,两者的压力抗性差异最大,而在10℃的生长条
件下,对数期与稳定期细胞的压力抗性差异较小,这可能与低温下稳定期内没有诱导形成相同特征的细胞有关。
3.3 细胞膜流动性与压力抗性的关系
以大肠杆菌脂肪酸营养缺陷型菌株为材料,就膜流动性对压力抗性的影响研究发现:37℃培养条件下,生长在棕榈酸中的对数期细胞的压力抗性低于生长在油酸或亚油酸中的细胞,这说明微生物的
压力抗性随着细胞膜流动性的增加而增强;而在稳定期,细胞的压力抗性差异较小,其中的原因不太清楚。
为什么细胞膜的流动性越大,压力对其的破坏越小?其机理有待进一步研究。压力可以引起磷脂间烃链相互靠近,类似于低温对磷脂分子的影[13]
响。细胞膜的流动性越大,压力引发其相变的几率越高,这意味着压力影响了膜脂的相变特征,并进而影响了细胞膜的损伤。通过降低温度使微生物细胞膜磷脂发生相变,对微生物而言不是致命的,但快速降温会导致对数期微生物细胞的死亡,而对稳定期细胞的影响不大。缓慢降温会导致细胞膜磷脂与蛋白质的分离,出现凝胶,并引起细胞内物质的泄漏。膜流动性的变化会对位于膜上的酶活性(如ATPase)、构象、定位产生影响,。3.,。大多数的微生物进入到稳定期或处于饥饿状态时,都会伴随着结构和生理特性的改变,并对热休克、氧化、渗透压、酸等外界胁迫的抗性增强。在大肠杆菌中,这些变化诱导着50多个基因的表达,它们大多数是由选择性的σ因子进行调控的,它对提高大肠杆菌O157的压力抗性发挥了重要作用,此外还涉及到通用胁迫蛋白(Universal
[14]
stressprotein,UspA)等其它调控单元。
通过显微镜观察蛋黄卵磷脂微囊在高压处理过程中的变化发现:加压时,磷脂囊的体积缩小,呈球状;撤除外界压力,囊球破裂,双分子膜消失。但内含胆固醇的材料中,可以减少加压过程中的体积变化,防止减压后囊球的破裂。如果类似的情况也发生在微生物的细胞膜上,那么细胞膜的脂肪酸构成会影响到微生物的压力抗性。在大肠杆菌中没有发现胆固醇,但其他的因素会影响到膜的压力效应。进入对数期后,大肠杆菌的细胞膜和细胞包膜会发生一些变化,包括不饱和脂肪酸转化成它们的环丙烷型衍生物;肽聚糖层增厚;肽-脂蛋白铰链度升高和膜蛋白的铰链。由于在30℃和37℃培养条件下,细胞膜中环丙烷型脂肪酸与压力抗性都处于最大
[15]
值,Peter证明环丙烷型脂肪酸对提高稳定期细胞的压力抗性发挥了重要作用。
4 结论
微生物的生长温度、细胞膜的脂肪酸构成及微
430微 生 物 学 报
[7][8]
45卷
生物所处的生长时期都会对微生物的压力抗性产生
影响。大肠杆菌对数期细胞的压力抗性随着培养温度的升高呈下降的趋势。而稳定期的细胞随着培养温度的升高,压力抗性呈增加趋势,30～37℃时达到最大,之后到45℃有下降。对数期细胞的压力抗性随着膜流动性的增大而升高;但稳定期细胞,膜流动性与压力抗性之间不存在简单的对应变化关系。微生物在不同生理时期对压力胁迫的应急反应不完全一样,这可以在分子水平上得到体现。
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Relationshipamonggrowthtemperature,membranefattyacidcomposition
andpressureresistanceofEscherichiacoli
LIZong-jun
3
(CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China)
Abstract:Therelationshipamonggrowthtemperature,membranefattyacidcompositionandpressureresistanceofEs2
cherichiacoliwasstudied.Resultsindicatedthatthepressureresistanceofexponential-phasecellwasmaximalincellgrowthat10℃anddecreasedwithincreasinggrowthtemperaturesupto45℃.Bycontrast,thepressureresistanceofstationary-phasecellwaslowestincellgrowthat10℃andincreasedwithincreasinggrowthtemperature,reachingamax2imumat30to37℃beforedecreasingat45℃.Theproportionofunsaturatedfattyacidsinthemembranelipidsde2creasedwithincreasinggrowthtemperatureinbothexponential-andstationary-phasecellandcorrelatedcloselywiththemeltingpointofthephospholipidsextractedfromwholecells.Therefore,pressureresistanceinexponential-phasecellin2creasedwithgreatermembranefluidity,whereasinstationary-phasecell,therewasapparentlynosimplerelationshipbe2tweenmembranefluidityandpressureresistance.
Keywords:Temperature,HighHydrostaticPressure,FattyAcid,Escherichiacoli
3
Correspondingauthor.Tel:86-731-4617007;Fax:86-731-4617013;E-mail:[email protected]
Receiveddate:27-09-2004