第二代测序技术在肿瘤诊疗中的应用及其价值与风险

第二代测序技术在肿瘤诊疗中的应用及其价值与风险 第二代测序技术在肿瘤诊疗中的应用及其价值与风险

樊绮诗1，吴蓓颖2

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院北院检验科，上海 201801；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025）

摘要：测序技术从第1代发展至今的第4代，读长从长到短，又再由短至长。每一次技术进步都有力地促进了生命科学和临床医学研究的发展。其中高通量测序又称下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术即二代测序技术因其通量大、精确度高且信息量丰富，不同的测序平台在通量、读长、准确度、速度和成本方面各具优势，在基因组从头测序、重测序、转录组及表观遗传学研究中发挥了重要作用。近年来，NGS的数据产出一直呈现出指数增长的趋势，并逐渐应用于个性化医疗和遗传诊断等临床服务。NGS在临床肿瘤的研究与检测中也显示出巨大的市场价值，但是在此背后却同时存在着一定程度的风险，不得不引起我们的重视和警惕。

关键词：高通量测序；肿瘤

测序技术诞生于20世纪50年代，经过30年的发展又诞生了第2代测序技术——高通量测序，又称下一代测序（next generation sequencing，NGS）。目前，第3代单分子测序技术、乃至最新的第4代固态纳米测序技术也相继问世。

NGS与Sanger测序技术都是基于边合成边测序或边连接边测序的原理。NGS主要包括全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、全外显子组测序（whole-exome sequencing， WES）以及目标区域测序（targeted region sequencing，TRS）[1-2]。与一代测序相比，NGS具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点，可以在较短时间内对感兴趣的基因进行精确定位，可以对未知的序列进行检测，也可以对某组织在某一时间表达的mRNA进行测序[3]。

1 NGS在肿瘤研究和临床诊疗中的应用

肿瘤是一种符合达尔文进化特征的疾病，超过80%的患者死于癌症的转移和复发。在原代肿瘤细胞中，进化一直存在，这在一定程度上造成了肿瘤的异质性和低频突变的特点。癌症基因组图谱和国际癌症基因组计划等工作鉴定出大量癌症类型的体细胞突变，大多数工作是通过外显子测序和全基因组测序完成的。在肿瘤的预防方面，NGS主要用于肿瘤基因的突变筛查；在治疗方面，通过NGS发现了数百个与癌症相关的基因，这势必会从中发现新的治疗靶点，用于个性化的用药指导；在肿瘤预后方面，NGS则可用于检测肿瘤复发和药效评估。

1.1 肿瘤诊断

在肿瘤的基因分析方面，由于目前生物标志物的应用都比较简单，可能低估了癌症的高度复杂性。未来的癌症治疗将突破针对单个突变进行单一治疗的模式，通过全外显子组的3 000多个基因，检测肿瘤的信号通路，这已在一些实验室中展开。而在临床应用方面，以乳腺癌为例，癌症基因组图谱测定了510个乳腺癌外显子组序列，将其分为4个亚型：luminal A、luminal B、HER2-enriched和basal-like。不同分型的乳腺癌最终会应用不同的治疗方案。结、直肠癌组织中NGAL和NGALR的阳性率分别为49.0%、35.4%，明显高于结、直肠腺瘤和正常黏膜组织，NGAL和NGALR的表达与肿瘤的浸润、远处转移和TNM分期均相关，因此有可能成为结、直肠癌临床治疗的新靶点。Illumina公司的TruSight Tumor主要用于全面查看实体瘤中的体细胞变异，包括肺癌、结肠癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌，深度覆盖了26个相关基因的175个扩增子，通过检测肿瘤相关区域的低频突变等位基因，凭借1 000×的测序深度，可以准确地分析变异，检测到＜5%的等位基因突变频率。

1.2 肿瘤治疗

“同癌不同治、不同癌同治”已经成为个体化医疗的一个原则[4]。靶向药物已改变了许多癌症的治疗和管理。最经典的例子就是治疗慢性粒细胞白血病的药物格列卫以及针对HER2阳性的乳腺癌的治疗药物赫赛汀[5-6]。目前，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变和间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）重排的检测已被广泛应用到非小细胞肺癌的筛查中，EGFR突变丰度越高，对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的治疗也越敏感[7]。又如甲状腺癌中，携带BRAF突变的患者预后差，而携带神经母细胞瘤ras（neuroblastoma RAS，NRAS）突变的患者预后则相对较好[8]。另一个有希望的靶向治疗是对去势难治性前列腺癌进行信号指导的雄激素受体治疗，这将让肿瘤增殖通路失活并抑制癌症发展。除此之外，美国食品药品监督管理局（U. S. Food and Drug Administration，FDA）已经批准认可了110个与癌症诊断和医疗相关的生物标志物位点，医生可以直接根据这些位点的突变制定医疗方案进行治疗。同时，随着药物易感基因和疾病易感基因检测的深入开展，个体化医疗在基因检测的基础上也将得以实现。

1.3 肿瘤预后

当肿瘤发生转移的时候，在选择压力下，单一克隆会产生针对癌症治疗方法的抗性。如乳腺癌等癌症，可能在诊断多年后才发生转移。而在晚期复发的癌症中，由于肿瘤休眠，可以在这种状态下传播到远处器官。在这个过程中，肿瘤细胞会积累表观遗传和遗传学上的进化特征，并在特定条件下发生明显转移。在转移过程中，因为无法准确捕捉具有时空特异性的肿瘤而导致癌症治疗失败。

近来，肿瘤循环DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作为液体活检的一种方案出现在我们面前。ctDNA来源于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞以及肿瘤细胞产生的外泌体。虽然ctDNA样本的取得相对简便，但含量极低，只占血浆循环DNA的0.01%～1.00%，直到NGS技术的出现才解决了从极低丰度样本中检测突变的难题。靶向深度测序和基于捕获测序的方法只是在指定区域进行检测，而外显子血浆DNA分析却开辟了一种新的机遇，即可以全面地描述突变组的特征，而不需要关注之前或者现在存在的突变。目前从非小细胞肺癌患者血液中已经可以获得ROS1、BRAF、KRAS、HER2、c-MET、RET、PIK3CA、FGFR1和DDR2等基因位点的突变信息，可以利用这些突变信息为患者选择合适的靶向治疗[9]。显然，用NGS进行ctDNA的外显子分析为肿瘤筛查、诊断和临床决策提供了一种新的途径和机遇，具有巨大的应用潜力。

2 NGS数据分析与结果解读的不确定性

在繁复的实验室步骤结束后，即可以得到大量的测序数据，对所得数据进行精确而有效的处理是NGS技术至关重要的一个环节，需要生物信息学和强大的硬件设备作为基础。

2.1 数据分析与结果解读

NGS数据分析过程中，任何与质控标准有偏离的环节都需要进行检查并制定对应的解决方案。导致偏离的原因包括符合质控要求的待测基因检测到的次数太少、检测出的变异数目明显偏离预期、样本标签序列被污染。这些原因均会导致检出的数显著增多。这些偏差都提示实验过程中的误差或分析中的失误。因此，每个实验室必须建立一个清晰的流程用以记录并调查这些偏差，寻找原因，建立合适的修正策略，并实施修正方案[10]。在肿瘤细胞基因突变的数据分析中，对于检测到的低频突变往往需要格外慎重，此时需要判断是由于肿瘤组织样本中突变原本就少，还是由于检测手段的局限导致了此结果。此时应当使用非NGS手段进行验证，验证方法可以是一代测序，但不仅仅限于一代测序。

2.2 结果分析的不确定性

对于变异的描述，可以就序列变异是否有报道、与公认的疾病是否有关以及是否检测出非预期疾病的基因等进行表述。基因型或基因变异的检验结果需明确描述所检验的基因位点或变异位点。必要时，在报告解释中进行详细说明。对于测序结果的报告应尽可能参考已有的疾病和/或基因相关的文献报道或疾病诊治指南，对于文献暂时尚未报道或不确定是否有临床相关性的变异，实验室需要制定相应的标准作出声明，并有后续的处理策略。对于阴性结果，并不能完全排除患者存在基因突变。对于药物治疗相关报告，应结合患者的临床资料以及比较全面的药物相关基因信息等给予用药建议。如果遇到检验结果与其他实验结果或临床资料不符，应进行调查并将资料备案，必要时进行验证。

对于NGS实验结果的解释，并非单纯地就所得结果进行描述，而应该参考患者临床相关信息和家属相关资料，将定性或定量的原始实验数据进行归纳和综合分析，对实验结果提供清晰和全面的解释，得出一个明确的结论。最终，NGS的结果分析需要技术人员与有临床经验的医师共同给出诊断性结论，而往往由于人们对疾病认识的程度和阶段不同，相同的结果在不同时间解读，可能会有不同的结论。例如在肿瘤检测中，在使用TRS方法检测时，对于我们已经熟知的肿瘤基因如KRAS、TP53等，其检测覆盖度可能会好于其他罕见的或是我们认为不那么重要的基因。由此可见，人们对肿瘤的认知在很大程度上影响了解读结果，这不得不视为是NGS检测过程中的一个难以规避的风险。

3 NGS技术局限性与影响因素

NGS技术本身的特性决定了其缺陷的存在，这些缺陷贯穿了从样本制备到结果报告的整个过程。实验过程的各种因素均会影响最终的报告结果。从样本制备、测序到数据分析，每一个步骤的选择均会影响NGS报告的结果。

3.1 技术的局限性

在制备测序文库的过程中必须经过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，因此在这个过程中必定会引入序列的突变或改变样本中核酸分子比例的关系。起始浓度低的样本随着扩增循环数的增加，此影响会更明显。由于NGS的读长总体偏短，在进行数据拼接时也会有错配的概率出现。

在操作方面，目前存在的最大挑战是需要建立标准的操作规范，包括样本的预处理、组织样本的分析和鉴定、仪器和软件的验收与选择、公共数据库的使用、不同医疗层级的测序数据观察、数据储存等。

在技术平台方面，每个平台在通量、成本、错误率以及读取结构上大相径庭。NGS研究最常用的Illumina平台稳定，数据可靠，但存在系统偏好性问题，且其高度的敏感性也随之带来了2.5%左右的错误率[11-13]。SOLiD系统使用的边连接边测序（sequencing by ligation，SBL）技术的准确率非常高（约为99.999%），但是在敏感性与特异性之间不能达到完美的平衡[14]。454平台和Ion Torrent平台虽然能够提供较长的读长（700和400 bp），但缺点是在插入与缺失，对同一碱基多聚体的测序误差甚至会达到6～8个碱基[15-16]。Ion Torrent平台在不断的改进后，运行时间为2～7 h，为同类中最快，但Ion Torrent平台的设备依赖于高质量的氩气，且高通量的Ion Proton与S5系统只能单向测序，不支持双向测序。

3.2 影响因素

3.2.1 样本 石蜡样本抽提过程中的去氨基化、打断的DNA片段的长度、标签的选择、建库样本混合个数、PCR富集的方法、测序样本浓度的确定、不同测序平台的选择、单向或双向测序的选择以及不同读长的选择等，最终都会导致测序得到的数据的量、数据准确度以及最终质量的差异。

3.2.2 实验室设置 在实验室硬件设置方面，NGS的实验室比常规PCR实验室有更高的要求，NGS中对于肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术+Sanger测序验证）的要求是最为严格的，需要8个区域，分别是试剂准备区、样本与文库制备区、DNA打断区、杂交捕获区（扩增Ⅰ区）、文库扩增区（扩增Ⅱ区）、文库检测区、测序区及电泳区。只有规范设置实验区域，才能降低或者避免实验中可能出现的污染。

3.2.3 人员资质 NGS技术对相关人员也有很高的要求：检测实验室的管理和技术人员必须具有专业基础、学术水平和教育培训的经历；对NGS实验室技术人员不仅需要有PCR实验室上岗证、而且还必须接受NGS技术的理论与实验培训并经考核合格。数据分析是NGS最关键的环节，要求数据分析员不仅需要有生物信息相关教育和训练背景、实践经验，还需要掌握一定的临床医学、医学遗传学、实验室技术等方面的专业知识，这样才能对实验所得的庞大纷杂的数据进行深度分析和有效利用，从中得出正确的结论。而具有交叉专业背景的数据分析员正是目前最缺的，有必要在本科教育甚至是研究生教育中开设相关专业，经过系统和规范的教育，培养出真正能胜任临床诊断需求的数据分析人员。

3.3 质量控制

NGS的实验室质量控制是实验成败、结果可靠与否的关键。虽然目前用于临床检测的基因测序项目有很多为商品化试剂盒，但绝大多数属于实验室自建试验（laboratory-developed test，LDT）。为了确保所获得的序列和结果分析能够指导临床决策，需要对测序的全过程，包括样本处理、检测步骤及数据分析解读等进行标准化。对于自建或商品化的检测系统，国家相关部门和指南已有具体的规定。这在原则和要求上，与国家对临床实验室质量控制的要求是一致的。

对于LDT，在正式用于临床之前应完成性能评估。如果仪器或关键试剂更换、检测样本类型变化，实验室必须重新进行验证。需要确认的参数包括正确度、精密度、线性范围、参考区间、分析灵敏度（检测下限）和分析特异性（抗干扰物质），其他涉及的重要指标（如样本稳定性、试剂稳定性等）的判断标准可由实验室自行决定。

使用由国家食品药品监督管理总局批准的检测系统的项目，需要先完成性能验证，需要验证的主要参数包括正确度、精密度、线性范围和参考区间。判断依据可以是试剂盒或检测系统说明书中提供的参数。另外，每个进行NGS的实验室还应该对验证方案作出明确的规定，必须有文件说明，哪些验证一定要做，而哪些则可以不需要做。

4 伦理学相关问题

NGS技术的临床应用涉及到一系列伦理学问题，在肿瘤中的应用也是如此。首先要认识到，NGS所检测到的基因突变并不能百分之百地确定与病症的相关性，需要累积相当数量的临床病例，这就使得基因数据库的建立成为必然，以便各方研究者共享信息。但这带来的问题就是患者的数据成为了研究目标，由于这些数据属于个人信息隐私，应该只能在患者知晓并同意的情况下才可进行，所以数据库的建立必须考虑有合适的工作程序。其次，NGS势必会带来“主动发现”，即会发现非原目标病因诊断以外的其他基因的突变，属于非目的性检测，而且还要考虑患者所拥有的“不想知情”的权力。因此，这些信息是否需要告知患者及其家属，通过什么途径告知，都需要立规立法在先，并严格遵守执行。另外，对于检测出的遗传缺陷的信息，还涉及到患者及其家属在医疗保险和工作雇佣时是否会遭遇到歧视，此时患者及其家属是否受到应有的法律保护。

在临床中是采用针对性的目的基因检测还是全外显子组测序或是全基因组测序，应该根据具体病例，经过充分考量和权衡利弊后再做决定，应该避免无限制地扩大新技术（包括NGS）的使用范围而对患者造成不必要的伤害。

5 总结

总之，NGS的发展必须依赖于大量的数据研究和临床发现的共同贡献、多专业间信息的共享及探讨，也鼓励多方听取患者意见，并加强基因检测的知识普及，以争取患者最大程度地正确理解测序在疾病诊断、治疗、预防中的作用和意义。当然，在NGS正式投入临床应用之前，必须建立相关指南或法规，以保证其发展的健康有序，这是使用NGS的科学家、临床医生、实验技术人员，乃至医疗行政管理部门必须思考的问题，亟待引起重视并加以解决。

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Value and risk of next generation sequencing in the diagnosis and treatment of cancer

FAN Qishi1，WUBeiying2.

（ 1. Department of Clinical Laboratory，North Campus，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University

School of Medicine，Shanghai201801，China； 2. Department of Clinical Laboratory，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai200025，China）

Abstract：Sequencing technology has been developed from the 1st generation to the 4th one，and the length of reads is from long to short and from short to long again. Its progress has promoted the development of life science and clinical medical research. Next generation sequencing （NGS） technology has high fl ux，high accuracy and huge quantity of information. Different sequencing platforms have their own advantages in fl ux，length of reads，accuracy，speed and cost. They play important roles inde novogenome sequencing，resequencing，transcriptome and apparent genetics. In recent years，the datum output of NGS shows the trend of exponential growth，and has been gradually applied to clinical services，such as personalized medicine and genetic diagnosis. NGS in clinical oncology research and determination also shows a huge market value，but at the same time it hides certain degree of risk，which should be paid great attention and vigilance.

Key words：Next generation sequencing；Cancer

文章编号：1673-8640（2017）04-0245-05

中图分类号：：R393

文献标志码：：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2017.04.001

（收稿日期：2016-08-21）

（本文编辑：范基农）

作者简介：樊绮诗，女，1953年生，博士，研究员，主要从事分子生物学和临床检验诊断学相关研究。