micRNA载体构建流程
micRNA 载体构建流程：
1． micRNA 片段PCR
(1) PCR体系：
5x PrimeSTAR buffer 10.0 µL
2.5 mM dNTPs mixture 4.0 µL Primer1 (10 uM) 1.0 µL Primer2 (10 uM) 1.0 µL PrimeSTAR HS 0.3µL 模板DNA 2µL ddH 2O 31.7µL
程序：
98℃ 1min；
98℃ 10s，55℃ 10min，72℃ 1.0min，30 cycles；
72℃ 10min
1.0%琼脂糖胶检测PCR 结果：上样5ul
注意：PCR 用50µL 体系重复两管，回收时，并成一管纯化。回收完后检测纯化产物OD 值，纯化产物含量最好高于50ng/ul，若产物浓度低，则再多做几份PCR 再回收。
(2) 纯化产物补A
上述纯化后，浓度达到要求的产物可进行补A ，用于后续连接。
补A 体系：
纯化产物： 16.8ul
10x PCR buffer： 2ul
dATP(10mM)： 1ul （终浓度2 mM）
rTaq ： 0.2 ul
反应条件： 72℃ 15-30min
补A 产物放于-20℃备用。
2. CD3-1250载体酶切
做第一步PCR 的同时，可先做载体酶切，做好准备。
酶切体系：
ddH 2O ： 34ul
10X NEB Buffer2: 5ul
Xcm1: 1-1.5ul
CD3-1250质粒： 10-20 ul
酶切重复6管，胶回收时可将2-3管合并为一管回收。
反应条件：37℃ 3-5小时或过夜。
1.0%琼脂糖胶检测酶切是否完全，若酶切完全，可进行后续回收。上样5ul ，检测时140-150V 电压，跑胶15-20min 即可，勿跑太长时间。
回收：制备一块1.0%琼脂糖新胶（大孔），将酶切产物全部上样，140V-150V 跑胶20min 左右。切胶回收大片段载体。
载体片段较大，需用天根胶回收纯化试剂盒回收。
回收完后检测纯化产物OD 值，载体纯化产物含量最好高于50ng/ul，若产物浓度低，则再多做几份酶切再切胶回收。
3. 连接反应：
体系：PCR 补A 产物（约50ng/ul）： 1.5ul
CD3-1250载体回收产物(约50ng/ul)： 1.5ul
Soltion I(TAKARA)： 3ul
条件：16℃ 3-5小时，或过夜连接。
4. 转化DH5α感受态细胞
将上述连接产物全部用于转化，涂布Kan 平板，Kan 终浓度50ug/ml。倒置培养过夜。
5. 重组子鉴定
（1）菌落PCR 鉴定或菌液PCR 鉴定阳性克隆。PCR 鉴定时别忘了加上阳性对照（col 做模板）、阴性对照（不加模板）。鉴定一般用自制TAQ 进行。
（2）挑选3-5个阳性克隆摇菌后提取质粒进行酶切鉴定。提质粒时用天根或生工提质粒试剂盒，集菌两次。质粒用BamH1进行酶切鉴定。
BamH1酶切鉴定体系：
ddH 2O ： 7ul
10X BamH1 Buffer: 2ul
BamH1: 0.5ul
重组质粒： 10.5 ul
条件：37℃ 2小时。
1.0%琼脂糖胶检测酶切结果，全部上样或上样10ul 检测，检测时140-150V 电压，跑胶
15-20min 即可，勿跑太长时间。
5. 阳性质粒转农杆菌
鉴定正确的质粒立即转入农杆菌中，保存菌种。
（1）将酶切鉴定正确的质粒，挑选3-5个，各取2ul 质粒混合后，全部转入农杆菌GV3101感受态细胞中，涂布Rif+Gen+Kan平板，28℃倒置培养两天左右。
（2）从平板上挑选两个克隆加入Rif+Gen+Kan的LB 液体培养基中摇菌，菌液摇好后做菌液PCR 鉴定。若菌液PCR 鉴定结果不好，可手工提取农杆菌质粒，用质粒进行PCR 鉴定。PCR 鉴定时别忘了加上阳性对照、阴性对照（不加模板）。鉴定一般用自制TAQ 进行。
（3）鉴定正确的平板，将平板上所有的菌斑用灭菌枪头刮下来，加入Rif+Gen+Kan的LB 液体培养基中摇菌过夜，菌液摇好后，保存甘油菌（500ul 菌液+500ul 50%灭菌甘油），存于-20℃。