血红素氧合酶_1_诱导型一氧化氮合成酶在局灶性脑缺血中的表达

第34卷第6期第662页华中科技大学学报(医学版) Vol. 34　No. 6　P. 662

　　　　　　　　

2005年12月Acta Med Univ Sci Technol Huazhong Dec. 　2005

血红素氧合酶21、诱导型一氧化氮合成酶

在局灶性脑缺血中的表达

符　荣　　赵洪洋　　赵甲山　　朱贤立

华中科技大学同济医学院附属协和医院神经外科, 武汉　430022

摘要　目的　观察两种不同信使分子CO/NO 的限速酶血红素氧合酶21(HO 21) 、诱导型一氧化氮合成酶(iN 2

OS ) 在局灶性脑缺血中的表达, 初步探讨HO 21、iNOS 在局灶性脑缺血中的不同作用。方法　采用免疫荧光技术,

观察HO 21、iNOS 在局灶性缺血脑组织中不同时间点的表达及分布。结果　iNOS 在海马、皮质、基底节均有分布以灶周皮质最多。HO 21在同侧海马、皮质、基底节、丘脑均有分布, 以灶周皮质为最多。iNOS 的表达在缺血后2h 出现, 24～48h 达最高峰, 以后逐渐下降。HO 21表达在缺血后015h 即出现, 缺血后6～12h 达最高峰。在缺血皮质半暗带的某些神经细胞有iNOS 及HO 21的共同表达。结论　脑缺血早期即有HO 21的表达, 而iNOS 表达则较晚出现, 其表达的高峰期晚于HO 21。在半暗带的某些神经细胞可见有HO 21和iNOS 的同时表达。

关键词　脑缺血, 局灶性; 血红素氧合酶21; 　一氧化氮合成酶中图法分类号　R743131

Expression of H O 21and iN OS in Fu Ro , et al

De partment of , , j i Medical College , H uaz hong Technolog y , W uhan 430022

Abstract 　To study the different roles of heme oxygenase 21(HO 21) and iNOS protein during permanent focal cerebral ischemia in rats 1Methods 　By using immunofluorescence , the co 2expression and distribution of HO 21and iNOS protein in the brains of focal ischemia at different time points were investigated , and the changes in fluorescent intensity were ob 2served 1R esults 　iNOS was expressed in hippocampus , cortex and basal nuclei , mostly in cortex around the ischemia area 1The iNOS positive neural cells were observed in 2h after ischemia , peaked at 24-48h , then slowed down , lasted till 7th day after middle cerebral artery occlusion (MCAO ) . HO 21was expressed in the collateral hippocampus , cortex , basal nuclei and thala 2mus , mostly in perifocal ischemic cortex 1With time going on , the number of HO 21immunofluorescence positive neural cells was increased , peaked at 6-12h , then slowed down , lasted till 7th day after MCAO 1The number of HO 21immunofluores 2cence positive neural cells was less than that of iNOS in the same area 1There was about 5%-10%neural cells co 2expressing HO 21and iNOS 1Conclusion 　In the early stage of cerebral ischemia , HO 21positive neural cells were observed 1The increased iNOS expression was later than that of HO 211The co 2expression of HO 21and iNOS was detectable in perifocal ischemic tissue 1

K ey w ords 　cerebral ischemia , focal ; 　heme oxygenase 21; 　inducible nitric oxide synthase

　　一氧化碳(CO ) 与一氧化氮(NO ) 一样是重要的气体信使分子。两种信使分子限速酶血红素氧合酶21(HO 21) 和诱导型一氧化氮合成酶(iN 2OS ) 在脑缺血中的作用分别已有报道, 但两者在脑缺血中的同时表达及相互关系国外鲜有报道, 国内未见报道。为此, 我们在局灶性脑缺血模型的基础上, 采用免疫荧光双标法对两种限速酶在脑缺血中的蛋白表达进行了动物实验研究。

1　材料与方法

111　动物及分组

符　荣, 男, 1967年生, 副教授, 博士后

健康雄性SD 大鼠60只, 体重280～320g , 由复旦大学医学实验动物中心提供。实验前12h 禁食水。大鼠随机分为10组, 每组6只。分为假手术组、缺血015、1、2、6、12、24、48、72、168h 各组。假手术组:线栓只插到颈内、颈外动脉分叉处。在相同条件下, 实验分批进行, 每批含各组大鼠1只。在制作局灶性脑缺血MCAO (middle cerebral artery occlusion ) 模型中,

凡手术中动物

符　荣等. 血红素氧合酶21、

诱导型一氧化氮合成酶在局灶性脑缺血中的表达

・663・

死亡、蛛网膜下腔出血或无左侧Horner 征以及右

侧偏瘫体征均为模型复制失败, 不记在内, 用来自同一批次的大鼠制成合格模型后补足数目。

112　实验试剂及仪器

范围内绿色和红色荧光神经细胞进行计数。

117　统计学处理

各组测定数据均用 x ±s 表示, 组间差异用完

全随机资料的t 检验、ANOVA 进行处理。2　结果

211　生理指标的测定

主要试剂:一抗为羊抗鼠HO 21抗体及兔抗大鼠iNOS 抗体, 购自Sant Cruz 公司, 稀释度均为

1∶100。二抗为FITC 荧光标记的小鼠抗羊Ig G 和Cy3标记的小鼠抗兔Ig G 试剂盒, 购自博士德公司, 稀释度均为1∶50。主要仪器:呼吸循环仪(nikn koken lifescope 12型, 日本) , SXP 21手术显微镜, 双极电凝器, 荧光显微镜。

113　动物麻醉及生理指标的监测

整个实验过程中大鼠动脉压、心率、呼吸均在

正常范围。各组之间生理指标测定值(大脑中动脉栓塞后1min ) 无显著差异。

212　MCAO 动物模型

用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg ) ,

股动脉插管, 连接呼吸循环仪监护血压、心率、呼吸。从解剖大鼠颈总动脉开始到线栓插入颈内动脉后5min 连续监测。记录各组大鼠大脑中动脉栓塞后1min 时的血压、呼吸、心率值, 进行各组间比较。

114　局灶性脑缺血模型的建立

所有大鼠在麻醉清醒后均呈现局灶性脑缺血表

现:右爪不能伸直或向右旋转爬行, 左侧Horner 征。

213　病理学观察

采用颈外动脉插入线栓法栓塞大脑中动脉制备脑缺血模型。参考Menzies 等[1]良。, 在25℃左右。:征, 115　免疫荧光染色

大鼠大脑中动脉栓塞模型所影响的脑区包括皮

质、纹状体、丘脑及下丘脑等4。缺血早期1h , 缺血皮质, 6、丘脑神经元呈空h , 到第7天时梗死灶内神经元已完全坏死, 仅残留少许胶质细胞。假手术组及正常对照组均无神经元变性坏死。

214　iN OS 和H O 21免疫阳性神经细胞的分布

建模成功后, 大鼠以1%戊巴比妥钠(40～50mg/kg ) 腹腔注射麻醉, 开胸经左心室插管至主动脉, 依次灌注生理盐水200ml , 4%多聚甲醛、013%饱和苦味酸、011mol/L PB 混合液300ml 。在各时间点取出全脑, 置入同一固定液中在4℃下固定36～48h 。常规乙醇脱水、石蜡包埋。切片机自视交叉处向后连续冠状切片, 片厚7μm 。免疫荧光染色按试剂盒说明书操作。100ml 羊血清

) , 羊抗鼠HO 21抗体及兔抗大孵育30min (37℃

) 。PBS 冲洗, FITC 鼠iNOS 抗体孵育16h (4℃

荧光标记的小鼠抗羊Ig G 和Cy3标记的小鼠抗兔) , 冲洗、封片、荧光显微Ig G 孵育90min (37℃

镜观片。对照:以0101mol/L PBS 代替一抗; 只加HO 21或iNOS 抗体。

116　观测项目

iNOS 阳性神经元在缺血后2h 可见有一定量

的表达, 主要分布于缺血侧海马、丘脑、纹状体、

灶周皮质, 到缺血后24～48h 表达急剧增高。缺血皮质、灶周皮质、缺血半暗带及海马表达最多。iNOS 阳性神经元呈红色荧光, 染色较深, 有多个突起, 密集分布。72h 后梗死灶中心阳性细胞急剧减少但仍有散在分布。假手术组未见iNOS 阳性神经元的表达。

HO 21阳性神经元在缺血015h 后即可见有少量表达, 分布于缺血皮质、缺血侧海马、丘脑、下丘脑、纹状体、灶周皮质, 缺血后6～12h 表达急剧增高, 主要分布于半暗带、缺血皮质、缺血侧海马, 以后表达减少。HO 21阳性神经元呈绿色荧光, 染色深, 多个突起, 弥散分布。假手术组未见HO 21阳性神经元的表达。

iNOS 和HO 21蛋白的共同表达:在缺血6h

在Olymp usBX60荧光显微镜下观片, FITC 激发波长为495nm , 发绿色荧光。Cy3激发波长为554nm , 发红色荧光。观察绿色和红色荧光阳性神经元在脑组织不同区域的分布。每只动物取出连续6张视交叉平面切片, 对单侧梨状皮质1mm 长度

开始, 缺血皮质半暗带内可见有少量神经细胞同时表达iNOS 和HO 21, 约占细胞数的5%～10%。缺血24h , 同时表达iNOS 和HO 21的细胞数增多, 约占细胞数的20%～30%。

・664・

华中科技大学学报(医学版) 　　2005年12月第34卷第6期

215　iN OS 和H O 21免疫阳性神经元数量

在荧光显微镜下, HO 21阳性细胞显示绿色,

iNOS 阳性细胞显示红色。实验组及假手术组阳性细胞定量分析结果见表1。空白对照实验结果为阴

性。iNOS 阳性神经元的表达在24～48h 达最高峰, 以后逐渐下降。HO 21阳性神经元的表达在6～12h 达最高峰, 以后逐渐下降但仍然维持较高水平。

表1　栓塞侧缺血脑皮质阳性细胞计数( x ±s )

　　组别假手术组梗塞组　梗塞后015h 　梗塞后1h 　梗塞后2h 　梗塞后6h 　梗塞后12h 　梗塞后24h 　梗塞后48h 　梗塞后72h 　梗塞后168h

例数

[1**********]6

3120±013612146±114926182±410349158±618168190±1018257115±917351150±513941173±613730152±3187HO 21阳性神经元

(个) 0

iNOS 阳性神经元

(个)

同时表达HO 21、iNOS 阳性神经元(个)

　0　

　0　

　0　　0　

34162±318667178±419088102±6158107174±71281371±9110871±5119061　0　　0　　0　

6182±518712189±610125145±4103106±2198169±41235182±1103

3　讨论

1的表达在缺血后015h 即出现, 6～12h 时达最

高峰, 以后逐渐下降, 到第7天时仍然维持较高水平。K oistinaho 等[9]研究认为梗塞区中心HO 21蛋白的表达较灶周皮质为强, 而梗塞灶边缘皮质内的细胞表达HO 21蛋白的速度最快。本次研究发现HO 21阳性神经元分布于缺血半暗带、缺血皮质、

6h 才出现, 48h 时达最高, 以后逐渐下降, 7天后降至正常水平[5]。本次实验显示, iNOS 的表达在缺血后2h 出现, 分布部位广泛, 到缺血24～48h 时阳

性细胞数达最高峰, 其分布范围主要在缺血皮质、海马、基底节。体外实验发现iNOS 表达增加谷氨酸毒性, 导致迟发性神经元损害。缺血后24h 选择性应用iNOS 抑制剂氨基胍可明显减少脑梗死灶

体积[6]。缺血晚期(6～12h ) , 组织损伤和神经免疫反应诱导并激活iNOS , 持续大量产生NO 及ONOO -, 引发晚期神经损伤。因此我们认为iNOS

缺血侧海马。而iNOS 阳性神经元主要分布于缺血半暗带、灶周皮质、缺血侧海马、基底节等部位, 两者在灶周皮质、缺血半暗带的分布部位基本重叠。HO 21的大量表达且维持较长的时间可能通过某种机制对抗iNOS 产生的NO 所造成的细胞毒性作用。脑缺血后01

5h 即有HO 21的表达且在缺血后6～12h 达最高峰, 表明HO 21的脑保护作用是迅速的。iNOS 的表达高峰期要晚于HO 21的表达高峰期, 说明在脑缺血早期的毒性作用并不是由iNOS 释放的NO 造成的。研究证实[10], 缺血初

是晚期神经元毒性损害的主要原因。

HO 是CO 产生的关键酶, 在HO 的作用下,

血红素氧化分解为螯合铁、CO 和胆绿素, 胆绿素随后降解为胆红素。HO 21即诱生型血红素氧合酶, 其快速持久地表达对缺血损伤后神经组织的恢复具有极其重要的生理意义。研究证实, 对局灶性脑缺血大鼠增加HO 21的表达能明显减少缺血梗死区的体积及脑水肿[7], 有助于保护神经元避免进一步遭受缺血损坏。其机制可能通过自身的抗氧化作用以及下游产物CO 起作用[8]。本研究证实, HO 2

期, 因钙通道的改变及谷氨酸作用致细胞内钙超载诱导nNOS 表达及活性增加, 产生大量NO , 产生细胞毒性作用。Namiranian 等[11]通过基因敲除技术研究了单纯敲除NOS 大鼠、单纯敲除HO 22大鼠以及同时敲除HO 22、nNOS 大鼠的神经功能缺失以及梗塞灶大小, 发现nNOS 的毒性作用能够显著拮抗HO 21对缺血脑组织的保护作用。因此我

符　荣等. 血红素氧合酶21、

诱导型一氧化氮合成酶在局灶性脑缺血中的表达

・665・

们推测HO 21的早期和大量的表达可能是针对缺血

早期由nNOS 产生的NO 的毒性作用。

本次研究同时发现, 大约有5%～10%的神经细胞同时表达HO 21及iNOS , 这些细胞大部分位于灶周皮质、缺血半暗带、缺血侧海马内。这表明细胞自身具有某种机制保护其免受进一步的损害。这一机制可能与NO/CO 两个信使系统之间的相互作用有关。研究表明[12,13]NOS 2NO 系统与HO 2CO 系统之间存在相互作用。有学者研究认为CO 通过HO 调节NOS 及NO 。HO 21的诱导可通过很多方面调节NO 的产生:①因为NOS 是一种血红蛋白, NOS 的激活位点需两分子血红素, 诱导的HO 可加速新合成的血红素的降解, 这样减少NOS 的合成[14]。②NOS 是一种P450型蛋白, 细胞色素P450是HO 21、HO 22的底物, 因而有理由认为HO 活性的增加可以加速NOS 的转化。③HO 产

456

7

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生的CO 结合NOS , 使之失活[15]。④在血红素降解过程中释放铁, 通过抑制NOS 的核转录而抑制NOS 的形成[16]。⑤HO 、NOS 系统都需要NAD 2P H , 在细胞内HO 较NOS 高, NADP H 有利于血红素的降解[17]。除了上述HO 节NOS 的机制外, HO 间接调节]。

考　文　献

1

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(2005207210　收稿)

　　(上接第661页)

进一步研究这些基因在急性髓系白血病细胞MDR

产生中的作用及机制奠定了一定的理论基础。

参　考　文　献

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(2005207215　收稿)