蛋白质组分分析方法比较研究
2005年8月第20卷第4期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and O ils A ss ociati on
Vol . 20, No . 4Aug . 2005
蛋白质组分分析方法比较研究
胡新中 郑建梅 魏益民
1
1
1, 2
张国权 张胜强 魏 强
111
(西北农林科技大学食品科学与工程学院1, 陕西杨凌 712100)
(中国农业科学院农产品加工研究所2, 北京 100094)
摘 要 21, 以比较
、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白; 、可溶性谷蛋白和不溶性谷蛋白。结果表明:单体蛋白与清蛋白、球蛋白、、球蛋白、谷蛋白之和均无关系; 可溶性谷蛋白含量与清蛋白、弱化度呈负相关, 与醇溶蛋白、谷蛋白、沉淀值呈极显著或显著正相关; 不溶性谷蛋白与醇溶蛋白、谷蛋白、沉淀值、稳定时间、评价值、弱化度呈极显著或显著相关。连续累进提取法适合于小麦品质常规检测, 快速提取法适用于小麦早代材料品质检测。两种方法对于预测小麦的加工品质有着相同的重要作用, 应根据样品量及检测精度进行选择。
关键词 蛋白质组分 连续累进提取法 快速提取法 比较分析
0 前言
1895年O sborne 根据谷物蛋白质溶解性质不同
的特点, 首次将小麦蛋白分离为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四种组分。其中清蛋白可溶于水, 球蛋白可溶于稀盐溶液, 清蛋白、球蛋白统称为可溶性蛋白; 醇溶蛋白可溶于中性乙醇溶液, 谷蛋白可溶解于
[1-2]
稀酸或稀碱溶液, 两者统称为不溶性蛋白。1962年,Maes 在前人研究的基础上, 对提取所需的溶剂、浓度、提取速度和定氮方法进行了系统的筛选研究, 提出了蛋白质组分的连续累进提取法和相应的凯氏
[3]
定氮方法。
快速提取法利用小麦蛋白质在碘化钠-正丙醇溶液、40%正丙醇、含有0. 2%2, 6-苏糖醇(DTT ) 的40%正丙醇溶液中的溶解性将蛋白质分离成单体蛋白(Monomeric p r otein ) 、可溶性谷蛋白(Soluble Glute 2nin ) 和不溶性谷蛋白(I ns oluble Glutenin ) , 并在不同
进行比色, 测定吸光度。用已知蛋白质组分含量的样
品作标准曲线, 进而计算出各样品蛋白质组分含[4-6]量。目前, 人们对于两种方法的测定结果间的对应关系还不十分清楚, 系统比较这两种方法, 认识两者之间的关系, 研究各方法中所得到指标的含义及各自对小麦籽粒品质性状的影响, 帮助人们根据需要选择具体蛋白质组分分析方法具有重要的意义。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
以2001～2002年度陕西省品种比较区域试验歧山试验点的21个小麦品种(品系) 为试验材料。籽粒经过清理, 分别测定其籽粒水分含量及籽粒硬度; 根据硬度润麦(硬麦水分调节到15. 5%, 软麦水分调节到14. 5%) , 用法国肖邦公司CD -1仿工业实验磨磨粉, 出粉率控制为65%左右, -5℃储藏备用。1. 2 试验方法1. 2. 1 蛋白质组分连续累进提取法: 根据邓妙、魏益民方法进行。提取步骤为向层析柱分别加入一定量酸洗过的石英砂和面粉样品, 再依次加入100mL 蒸馏水、100mL 氯化钠(0. 5N ) 溶液、100mL 异丙醇溶液(50%v/v ) 及100mL 氢氧化钾(0. 1N ) 溶液, 调节提取液的流速为0. 5mL /m in (1滴/6秒) , 收
[1]
的离心力下分离各蛋白组分, 然后在590n m 波长下
基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(2004C1-21) 和西北
农林科技大学青年基金资助项目
收稿日期:2004-05-11
作者简介:胡新中, 男, 1972年生, 在读博士, 谷物化学的教学和
研究工作
第20卷第4期胡新中等 蛋白质组分分析方法比较研究
取法的提取效率低于连续累进提取法。
13
集到的提取液分别为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷
蛋白; 组分含量测定用常量凯氏定氮法。试验设重复两次, 结果取平均值。1. 2. 2 蛋白质组分快速提取法: 根据W ang 和Ko 2
[4-5]
vacs 的方法进行。称量100mg 小麦粉, 分别用1. 0mLNa I -正丙醇溶液提取单体蛋白, 用1. 0mL40%正丙醇溶液提取可溶性谷蛋白, 用1. 0mL2, 6苏糖醇(DTT ) -正丙醇溶液提取不溶性谷蛋白。将以上步骤重复2次, 最后将三次提取液混合, 放在避光处保存备用。提取液加入一定量的三氯乙酸混合均匀, 用比色法在590n m 波长条件下测定溶液的吸光度用标准样品的单体蛋白、设重复两次, 1. 2. 3 其它小麦品质性状测定方法:粉质参数—AACC2000, 54-21; S DS 沉淀值—AACC2000, 54-601. 2. 4 数据处理:采用微软公司的Excel97软件及S AS 软件, 主要进行了多重比较分析及相关分析。
表1 连续累进提取法测定的蛋白质组分 单位:g 蛋白/100g干基样品品种名称中墨2号中科小偃866陕资1869西农1330花育8号
95(18)
西农199
-3
H 2 结果与分析
2. 1 连续累进提取法与快速提取法重现性分析
农林9823远丰998小偃22小偃6号陕229小偃107小偃503西农1718小偃128小偃54平均值
清蛋白球蛋白3. 48±0. 06a 1. 47±0. 02b 2. 48±0. 12gh 1. 23±0. 05def 2. 95±0. 06d 1. 15±0. 01f 3. 17±0. 10c 1. 39±0. 01bc 2. 51±0. 08gh 0. 96±0. 07g 3. 27±0. 19bc 1. 26±0. 10c 2. 71±0. 01ef 1. 60. 2. 27±0. . 10cd 2. 40. 200. 2. 32±0. 05cde 3. 36±0. 05ab 1. 49±0. 06b 2. 38±0. 01hi 1. 23±0. 01def 2. 32±0. 16gh 1. 33±0. 00cde 1. 49±0. 01k 1. 50±0. 01b 2. 09±0. 04j 0. 94±0. 03g 2. 05±0. 02j 1. 16±0. 05f 2. 44±0. 03hi 1. 03±0. 01g 2. 33±0. 01hi 1. 00±0. 01g 3. 28±0. 00bc 1. 22±0. 02ef 3. 35±0. 01abc 1. 24±0. 03def 2. 86±0. 02de 1. 33±0. 04cde
2. 66
1. 26
醇溶蛋白
4. 10±0. 09g 4. 64±0. 01d 3. 58±0. 01k 3. 05±0. 03m 4. 10±0. 03g 3. 80±0. 02ij 5. 14±0. 01c 4. 47±0. 00e 3. 97±0. 01h 3. 00±0. 05m 3. 98±0. 06h 4. 36±0. 00f 4. 13±0. 08g 3. 75±0. 01j 5. 30±0. 06b 4. 37±0. 02f 3. 89±0. 05hi 3. 76±0. 01j 3. 30±0. 07l 3. 76±0. 01j 5. 53±0. 04a
4. 09
谷蛋白
5. 00±0. 02b 3. 90±0. 07f 3. 79±0. 05f 3. 40±0. 10h 4. 91±0. 01b 3. 54±0. 03g 2. 98±0. 08j 4. 44±0. 00g 3. 56±0. 01g 3. 24±0. 00i 3. 18±0. 04i 3. 64±0. 07g 4. 15±0. 02e 3. 39±0. 03h 5. 18±0. 03a 4. 19±0. 06e 4. 44±0. 03d 4. 66±0. 04c 4. 09±0. 03e 3. 92±0. 04f 4. 91±0. 06b
4. 02
注:蛋白质组分表示格式为:组分平均值、极差, 后边的字母表示样品的在1%水平的差异显著性, 无相同字母表示样品间差异显著。表2 快速提取法测定的蛋白质组分 单位:g 蛋白/100g干基样品品种名称
中墨2号中科小偃866陕资1869西农1330花育8号
95(18)
连续累进提取法分离的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白两次测定结果的极差分别为0. 08、0. 06、0. 09和0. 07(表1) , 相对误差分别为0. 95%, 1. 44%, 0. 40%及0. 51%, 说明连续累进提取法具有很好的重现性和较高的测定精度。从其组分含量的分布来看, 醇溶蛋白平均含量最高, 其次为谷蛋白、清蛋白和球蛋白。这与李志西等人的研究结果相[7]
同。快速提取法单体蛋白、可溶性谷蛋白和不溶性谷蛋白的极差平均为0. 10、0. 25和0. 18(表2) , 相对误差为0. 90%, 3. 13%及1. 05%, 实验精度虽不及连续累进提取法, 但完全能够满足试验测定的需要, 其含量高低顺序为, 单体蛋白、不溶性谷蛋白和可溶性谷蛋白。两种蛋白质组分测定方法同样具有良好的重现性和可靠性。2. 2 连续累进提取法与快速提取法测定结果比较分析
为了比较两种测定方法的提取率, 将测定的蛋白质组分含量用占样品总蛋白质的比例来表示(表3) , 可以看出, 快速法测得的单体蛋白含量低于连续累进提取法所测的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白三者含量之和, 平均低5. 3%;而快速提取法所测定的可溶性谷蛋白和不溶性谷蛋白含量之和高于连续累进提取法所测的谷蛋白含量, 平均高7. 8%;从提取率来看, 快速法的提取率平均为88%;连续累进提取法为91%, 快速提
西农199
8839-3
小偃921
H -46
小偃137农林9823远丰998小偃22小偃6号陕229小偃107小偃503西农1718小偃128小偃54平均值
单体蛋白可溶性谷蛋白8. 11±0. 02a 0. 77±0. 00gf 6. 34±0. 06ghi 1. 27±0. 02bc 7. 22±0. 08de 0. 80±0. 09efg 5. 70±0. 14j 0. 99±0. 08def 6. 38±0. 02ghi 1. 41±0. 04b 7. 02±0. 12ef 0. 94±0. 12def 6. 46±0. 07ghi 1. 35±0. 12bc 6. 70±0. 10fg 1. 41±0. 06b 6. 30±0. 16hi 1. 33±0. 00bc 6. 57±0. 11gh 0. 66±0. 06g 7. 62±0. 25bc 0. 89±0. 01efg 7. 03±0. 18ef 1. 76±0. 13a 6. 99±0. 05ef 1. 39±0. 13b 7. 83±0. 19ab 0. 87±0. 03efg 7. 05±0. 17ef 1. 76±0. 18a 6. 96±0. 16ef 1. 44±0. 08b 6. 16±0. 04i 1. 48±0. 25b 8. 12±0. 19a 1. 15±0. 08cd 6. 70±0. 12fg 0. 65±0. 00g 7. 50±0. 30bcd 1. 02±0. 08de 7. 31±0. 12cde 1. 83±0. 07a
6. 96
1. 20
不溶性谷蛋白
4. 20±0. 09b 3. 80±0. 07c 3. 03±0. 05fg 2. 24±0. 01i 3. 81±0. 05c 3. 03±0. 13fg 4. 40±0. 02ab 3. 85±0. 10c 3. 45±0. 08de 3. 01±0. 07fg 2. 82±0. 11gh 3. 33±0. 14e 3. 81±0. 12c 2. 62±0. 08h 4. 39±0. 10ab 3. 42±0. 07de 3. 62±0. 03cd 4. 13±0. 20b 3. 31±0. 00e 3. 25±0. 00ef 4. 58±0. 01a
3. 53
注:蛋白质组分表示格式为:组分平均值、极差, 后边的字母表示样品的在1%水平的差异显著性, 无相同字母表示样品间差异显著。
14中国粮油学报
表3 连续累进提取法与快速提取法测定的蛋白质组分结果比较(%蛋白质)
连续累进提取法 快速提取法
品种名称
清蛋白
22. 5817. 9722. 8726. 0519. 8724. 1719. 1915. 7618. 4522. 3725. 0918. 0910. 15. 17. 5821. 3819. 8024. 7924. 7117. 7020. 06
2005年第4期
球蛋白
9. 548. 918. 9111. 427. 609. 3111. 339. 31C9. 2211. 1911. 13786. 949. 959. 038. 509. 229. 148. 239. 46
醇溶蛋白
26. 6133. 6227. 7525. 0632. 4628. 0936. 4031. 0430. 5125. 428226. 9439. 1437. 4834. 0931. 9524. 9427. 7334. 2230. 77
谷蛋白
32. 4528. 2629. 3827. 9438. 8826. 1621. 1030. 8327. 3629. 9624. 3538. 2635. 9338. 9139. 5930. 9128. 9130. 3830. 40
合计
91. 1888. 7688. 9190. 4798. 8187. 7388. 0286. 5488. 2386. 1372. 7799. 78100. 94103. 4199. 8489. 8690. 4990. 5390. 69
单体蛋白
53. 0248. 3261. 3852. 6043. 5060. 3242. 4459. 8656. 8257. 1465. 9144. 9651. 5147. 4061. 4958. 4965. 2853. 9555. 03
可溶性
谷蛋白
5. 8411. 677. 8410. 3010. 499. 137. 677. 9515. 3312. 508. 3512. 1611. 6812. 389. 406. 769. 9314. 4910. 48
不溶性谷蛋白
27. 3831. 3925. 7220. 5125. 9126. 0234. 0330. 8328. 9629. 3222. 0626. 8931. 0121. 9727. 9325. 2827. 8330. 2728. 7728. 1533. 6727. 80
合计
86. 2491. 3894. 9483. 4179. 9095. 4787. 9797. 1694. 23101. 2689. 8799. 04100. 6596. 2385. 0588. 4787. 61101. 1694. 02103. 36102. 1193. 31
中墨2号小偃866陕资1869西农1330花育8号
95(18)
西农199
8839-3
小偃921
H -46
小偃137农林9823远丰998小偃22小偃6号陕229小偃107小偃503西农1718小偃128小偃54平均
2. 3 两种蛋白质组分提取法测定结果之间的关系
表4 两种蛋白质组分提取法测定结果之间相关性
清蛋白+
清蛋白
单体蛋白
可溶性谷蛋白不溶性谷蛋白可溶性+不溶性谷蛋白
-0. 05 -0. 483-0. 14 -0. 30
球蛋白 0. 13
-0. 35-0. 22-0. 30
醇溶蛋白
-0. 09 0. 78330. 78330. 8733
谷蛋白
0. 24 0. 423 0. 66330. 6433
球蛋白+-0. 14 0. 27 0. 5230. 483
清蛋白+球蛋白
0. 08-0. 523-0. 19 -0. 35
醇溶+谷蛋白
0. 19 0. 72330. 86330. 9033
3-5%显著相关; 33-1%显著相关
单体蛋白含量与清蛋白含量、球蛋白含量、醇溶蛋白含量及清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白之和均无关系, 这与Sap irstein 的单体蛋白等于清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白之和的结果不一致
[8]
性谷蛋白及不溶性谷蛋白含量均与醇溶蛋白、谷蛋白含量密切相关。
2. 4 蛋白质组分与其它小麦品质指标间的关系
; 可溶性谷蛋白含量与
清蛋白含量呈显著负相关, 与醇溶蛋白含量及醇溶蛋白和谷蛋白之和呈极显著正相关, 与谷蛋白呈显著正相关。醇溶蛋白与可溶性谷蛋白的关系大于谷蛋白与可溶性谷蛋白的关系, 这是因为可溶性谷蛋白中混溶有一定量的醇溶蛋白和部分低分子量谷蛋白, 对快速提取法的结果进行电泳分析结果也证明了此现象(胡新中, 待发表) ; 不溶性谷蛋白含量与醇溶蛋白含量、谷蛋白含量及两者之和均呈极显著正相关; 可溶
快速提取法中可溶性谷蛋白含量与S DS 沉淀值
呈显著正相关(表5) , 与粉质仪弱化度呈显著负相关; 不溶性谷蛋白含量与S DS 沉淀值及粉质仪评价值呈极显著正相关, 与粉质仪弱化度呈极显著负相关。连续累进提取法球蛋白与S DS 沉淀值呈显著正相关, 与弱化度呈显著正相关; 醇溶蛋白、谷蛋白含量均与S DS 沉淀值、评价值呈极显著或显著正相关, 与弱化度呈显著负相关。用连续累进提取得到的谷蛋白与粉质仪稳定时间无相关关系, 而与弱化度、评价
第20卷第4期胡新中等 蛋白质组分分析方法比较研究15
值均呈显著相关, 此结果还需进一步讨论。
蛋白和不溶性谷蛋白需要4. 5小时, 用比色法定氮每
批24个样品仅需40m in, 且重复性高。而连续累进提取法提取完清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白共
评价值
-0. 070. 370. 7633-0. 08-0. 370. 4530. 473
表5 两种蛋白质组分分离方法与其它品质间关系
S DS 沉淀值 稳定时间
弱化度
0. 07-0. 453-0. 73330. 21
单体蛋白-0. 12 -0. 19
可溶性谷蛋白0. 473 0. 16 不溶性谷蛋白0. 72330. 523清蛋白-0. 14 -0. 06 球蛋白-0. 533 -0. 18 醇溶蛋白0. 463 0. 24 谷蛋白0. 54330. 22
需12h, 定氮分析每批6个样品, 需要3h;
从两种蛋白质组分分离方法中可溶性谷蛋白含量及不溶性谷蛋白含量, 醇溶蛋白及谷蛋白含量对沉淀值、粉质仪稳定时间的贡献与前人的研究结果基本相同, 。快速提取法具有样品用量小、, 适合于, , , 适合于品质检测实
[11]
验室进行常规检测, 缺点是测定周期长。
0. 5433-0. 443-0. 503
3 讨论
白质组分快速提取法提取的蛋白质组分单体蛋白含量与清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量之和未出现Sa 2p irstein 所提出的对应关系, 是因为提取的组分混溶所致。
醇溶蛋白和谷蛋白的混溶现象是蛋白质组分分离的最大难题。利用O sborne 方法提取醇溶蛋白和谷蛋白组分时常会发生交融现象, 一部分低分子量谷蛋白被提取到醇溶蛋白的组分中, 而一部分高分子量
[8]
醇溶蛋白被溶解于谷蛋白组分中。因为低分子量谷蛋白亚基的遗传较复杂, 控制L MW -GS 的基因与控制醇溶蛋白的基因紧密连锁, 而且L MW -GS 和醇
[9]
溶蛋白分子量接近, 难以分离。
快速提取法与传统的连续累进提取法相比虽然有其自身的优点, 但还需要对大量的样品进行大量的试验来最终确定合适的提取参数, 如提取所需的溶剂浓度、提取速度、提取温度等。Dupuis 等(1996) 研究表明, 50%正丙醇可溶性蛋白质中包括单体蛋白和可溶性谷蛋白, 其中可溶性谷蛋白含量占面粉总蛋白质含量的10%～19%, 约占总谷蛋白含量的25%～49%; 而O sborne 蛋白质组分分离中的谷蛋白指醋酸可溶性蛋白质及残渣蛋白。Kruger (1988) 认为O s 2borne 法提取温度较低(4℃) 导致提取率降低, 在60℃下, 0. 5M 氯化钠和50%丙醇提取的蛋白质占58%～64%。单体蛋白含量范围为48%～52%; 不
致谢:
感谢国家小麦品质改良中心杨凌分中心及生物技术育种中心给予试验仪器使用便利及经费支持; 感谢宋哲民老师提出论文修改建议。
参 考 文 献
[1] 邓妙, 魏益民. 蛋白质组分的连续累进提取分析法. 西北
农业大学学报, 1989, 17(1) :110-113
[2] Bean . S . R. , Lyne, R. K . , Tilley, K . A. , et al. L. A rap id
method f or quantitati on of ins oluble poly metric p r otein in fl our . Cereal Chem, 1998, 75:374-379
[3] W ang . C . , Kovacs, M. I . P . , et al . Efficiency of different
concentrati ons of ethanol and p r opanel f or gladin and glute 2lin extracti ons . 1998et al Pages 219-223in:Wheat p r o 2tein -p r oducti on and marketing . D. B. Fowler, W. sity of Sasdatche wan :Sasdatchewan . Canada
[4] W ang . C . and Kovacs, M. I . P . S welling index of glutein
test Ⅰ:M ethod and comparis on with sedi m entati on, gel -p r otein, and ins oluble glutein test . Cereal Che m, 2002, 79(2) :183-189
[5] W ang . C . and Kovacs, M. I . P . S welling index of glutein
test Ⅱ:App licati on in p redicti on of dough p r operties and end -use quality . Cereal Che m, 2002, 79(2) :190-196[6] 胡新中, 魏益民,M. I . P . Kovacs 等. 谷蛋白溶涨指数与
E .
Geddes, A. M. Johns on . and K . R. Pest on. eds, univer 2
溶性谷蛋白含量约占30%～42%。O sborne 酸溶性蛋白质组分并不能反应面粉中可溶性谷蛋白的含[10]
量。
本试验中使用的快速提取法测定蛋白质组分含量与传统的连续累进提取法相比提取时间与定氮时间都大大缩短。快速提取法提取单体蛋白、可溶性谷
蛋白质和面条品质关系. 中国农业科学, 2004, 37(1) :
119-124
[7] 李志西, 魏益民, 张建国, 等. 小麦蛋白质组分与面团特
性和烘焙品质关系的研究. 中国粮油学报, 1998, 13
(6) :1-5
16中国粮油学报2005年第4期
[8] H. D. Sap irstein , B. X . Fu . I ntercultivar variati on in the
quantity of monomeric p r oteins, s oluble and ins oluble glu 2tenin, and residue p r otein in wheat fl our and relati onshi p s t o bread making quality . Cereal Chem, 1998. 75(4) :500-507
[9] 邓志英, 田纪春. 小麦贮藏蛋白与小麦品质性状的关系
[10] Dupuis, B. , Bushuk, et al . Characterizati on of acetic
acid s oluble fracti ons of glutenin in bread wheat . Cereal Chem, 1996. 73:131-135
[11] 胡新中, 魏益民, 张国权, 等. 小麦籽粒蛋白质组分及其
与面条品质的关系. 中国农业科学, 2004, 37(5) :170-174
及其研究进展. 生命科学, 2003, 15(4) :232-237
Co mparis on of T wo Methods f Pr on
Hu Xinzhong in Zhang Guoquan
11
W ei Q iang
of Food Science &Engineering, North west Sci -Tech University of Agriculture &Forestry , Yangling, Shanxi 712100)
(I nstitute of Agricultural Pr oducts Pr ocessing, Chinese Acade my of Agricultural Sciences, 2Beijing 100094) Abstract T wo wheat p r otein fracti onati on methods, the sequence -p r ogressi on fracti onati on method and rap id fracti onati on method were p racticed with 21wheat fl our sa mp les f or a co mparis on . The sequence -p r ogressi on frac 2ti onati on method separates wheat p r otein int o albu m in, gl oublin, gliadin, and glutenin; the rap id extracti onati on p r o 2cedure separates wheat p r otein int o monomeric p r otein, s oluble glutenin, and ins oluble glutenin . The monomeric p r o 2tein has no correlati on with album in, gluoblin, gliadin, and co mbinati on of albu m in, gluoblin and gliadian . The s olu 2ble glutenin is negatively correlative t o albu m in content, and positively correlative with gliadian, glutenin, and sedi 2mentati on volu me . The ins oluble glutenin is highly or significantly correlative t o gliadian, glutenin, sedi m entati on v ol 2ume, stability ti m e, volri m eter value, and s often degree . The sequence -p r ogressi on fracti onati on method can be used in r outine wheat quality testing; the rap id fracti onati on method has the advantage of s mall size, and is suitable for wheat breeding p r ogra m. These t w o p r otein fracti onati on methods are both i m portant f or p redicting wheat p r ocessing characters, and can be an op ti on according t o the sa mp le size and measure p recise require ment .
Key words wheat p r otein fracti on, sequence -p r ogressi on fracti onati on method, rap id fracti onati on method, comparis on
1
1121