泥鳅的凡隆气单胞菌感染

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文章编号:1002-2694(2008) 12-1100-03

中国人兽共患病学报Chinese Jo urnal of Zoo no ses

2008, 24(12)

泥鳅的凡隆气单胞菌感染3

秦　蕾, 徐　静, 张晓君

摘　要:目的　2007年9月江苏东海一家泥鳅养殖场的泥鳅发病。病鱼外观症状表现为身体发红, 体表有出血点, 病情严重者皮肤出现溃疡灶。患病泥鳅死亡率高达60%。为弄清此次疾病的发病原因, , 对该病的病原进行了研究。方法　从患病泥鳅体内分离到1株优势菌株NQ , A PI 自动鉴定相结合的方式对病原菌株NQ 进行生理生化特性的测定, 构建系统发

育树。综合菌株NQ 的生理生化特征和16S rDNA 人工感染试验证实菌株NQ 为此次泥鳅发病的致病原, biovar sobria ) 。

关键词:泥鳅; 　　中图分类号:Infection veronii biovar. sorbria in Mis gur nus a nguillica udat us

Q IN Lei 1,XU Jing ,ZHAN G Xiao 2jun

(Key L aboratory f or Oceanic B iotechnology of J iangsu , H uai hai I nstitute of Technolog y , L iany ungang 222005, Chi na )

ABSTRACT :In September 2007, an outbreak of disease in Mis gurnus anguillicaudatus was found in Donghai district of Jiangsu province with symptoms of redness of body , bleeding spots on the body surface and ulcer foci in severe cases of the dis 2eased fishes. The mortality of the diseased fishes was rather high , approaching up to 60%.One dominant strain of bacteria was isolated f rom the diseased fishes , designated as NQ strain , and the physiological and biochemical characteristics of this strain of bacteria were investigated by routine bacteriological methods and the A PI automatic identification assay. In addition , the 16S rDNA sequence of the NQ strain was analyzed with PCR. and virulence test was also performed to find out its pathogenicity . Finally , the NQ strain of bacteria was identified as A eromonas veronii biovar sorbria.

　　KE Y WOR DS :M is gurnus anguillicaudatus ; A eromonas veronii biovar sobria

　　泥鳅(M is g urnus ang uillicau dat us ) 属鲤形目,

鳅科。其味道鲜美, 肉质细嫩, 营养丰富, 被誉为“水中人参”。随着市场需求量的不断增加, 泥鳅养殖得到迅猛发展。然而随着泥鳅养殖业的发展, 病害问题也日渐突出。目前所发现的泥鳅疾病主要是由温和气单胞菌〔1〕、创伤弧菌〔2〕和泥鳅气单胞菌〔3〕等感染引起的细菌性疾病。迄今为止, 尚无凡隆气单胞菌引起泥鳅疾病的研究报道。本文报告凡隆气单胞菌感染泥鳅的研究结果, 为预防和治疗该病提供理论依据和参考。1　材料与方法

1. 1　病鱼样品　2007年9月, 江苏东海一家泥鳅养殖场的

泥鳅发病, 从该养殖场随机取得10尾患病泥鳅。

1. 2　病鱼检查　肉眼观察病鱼外表, 鳃丝以及内脏器官等

表病灶、肝和肾等组织少许, 剪碎后TSB 平板划线分离,

28℃恒温培养箱培养24h 。从平板上形态一致的优势菌落中选取单个菌落, 再次进行平板划线, 直至获得纯培养。1. 4　人工感染试验1. 4. 1　试验用鱼　试验用健康泥鳅共计18尾(平均体长10±0. 6cm ) , 取自江苏赣榆一家未发病的泥鳅养殖场。按每个150L 的塑料缸中放养6尾, 暂养1w , 水温控制在25±1℃, 确认无病后开始试验。1. 4. 2　菌悬液制备　将纯培养菌株接种于新鲜TSB 琼脂培养基上,28℃培养24h 后, 用无菌生理盐水洗下菌苔, 制成菌悬液, 以麦氏比浊法制得8×106CFU ・mL -1浓度的菌悬液。1. 4. 3　攻毒试验　将每缸设为1组, 设平行组用于所分离到的菌株的攻毒试验, 腹腔注射泥鳅(0. 1mL/尾) ; 同时设对照组, 注射同等量灭菌生理盐水。

　　3淮海工学院引进人才科研启动经费(KQ07051) ; 淮海工学院自

然科学基金资助项目(Z2006036) 联合资助　　作者单位:淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室, 连云

港　222005; Email :qinlei1978@163. com

的宏观病理变化, 然后取病鱼的鳃丝、肝脏和肾脏等器官组织做成水侵片, 显微镜检查, 排除寄生虫和霉菌感染的可能性。

1. 3　病原菌的分离　在无菌条件下解剖病鱼, 分别取其体

2008, 24(12) 1. 5　病原菌的分类鉴定

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1. 5. 1　形态学观察　纯培养的细菌于28℃培养24h 后, 按

常规方法进行革兰氏染色和显微观察。1. 5. 2　生理生化测定　采用法国2梅里埃(BioM érieux ) 公司的API ID 32E 鉴定条并结合传统的手工鉴定方法对纯培养24h 的菌株进行生理生化特性的测定。1. 5. 3　病原菌的16S rDNA 序列分析　　(1) 细菌DNA 的制备　挑取28℃培养24h 的细菌的单一菌落于无菌去离子水中, 100℃水浴10min 后, 4℃12000rpm 离心5min , 上清即为PCR 扩增的模板DNA 。　　(2) 序列扩增与测序　采用细菌16S rDNA 序列扩增的通用引物(正向引物27f :5’2A GA GT T T GA TCCT GGCT 2CA G 23’; 反向引物1492r :5’2TACGGCTACCT T GT 2

) , 对纯培养的细菌16S rDNA TACGAC T T 23’

μl 的PCR PCR PCR 扩增, 在50

L , 液,2. 5mmol/L ,4μmol/L , 5U/) , l DNA 模0. 2

板。反应条件为; 接94℃变性40s ;50℃复性30s ;72℃延伸,30个循环; 最后72℃温育6min 。扩增产物交由上海生物工程技术公司测序。

　　(3) 序列分析与系统发育树的构建　测序的结果登陆G enBank 进行Blast , 选取与NQ 菌株16S rDNA 序列同源性较高的16株气单胞菌属细菌以及2株亲缘关系相近的弧菌属的细菌, 采用Mega 4软件进行多序列匹配分析后, 采用邻位相连法(Neighbor 2joining method ) 构建系统发育树, 所构建发育树各分支的置信度由Bootstrap 进行1000次循环检验。

染菌株, 因此可认为此次感染试验泥鳅发病死亡是由菌株NQ 感染造成的。对照组泥鳅亦无发病与死亡。

表1　人工感染试验结果

T ab. 1　R esult of ch allenge test with Misgur nus a nguillicau 2

datus

分组感染组尾数

666

每天死亡尾数

[1**********]10

死亡率(%)

1001000

2. 5形态及生理生化测定　对菌株NQ 进行生

2　结　果

2. 1　患病泥鳅临床症状　患病泥鳅躯干部和头部的腹侧皮肤、胸鳍和腹鳍发红, 随着病情的发展体表出现出血点, 部分病鱼表现全身皮下组织出血, 身体

显著发红。严重者病灶处发生溃疡。该病的死亡率可高达60%。2. 2　水浸片检查　对10尾病鱼的水浸片检查均发现了大量的细菌, 没有发现霉菌和寄生虫, 因此可以排除此次发病由霉菌或寄生虫导致的可能性。2. 3　病原菌的分离　从所有病鱼的体表病灶、肾脏和肝脏中均分离到了一株优势菌株, 命名为菌株NQ 。TSB 培养基28℃培养24h 时菌落直径在1. 3mm 左右, 菌落形态为圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明、灰白色和中间略隆起。培养48h 后菌落呈扁平形态, 中央点状突起明显。2. 4　人工感染试验　感染组在感染后1d 有4尾泥鳅出现死亡, 死亡病鱼身体轻微发红, 体色发暗。此后陆续有泥鳅出现身体发红、游泳活力减退等症状, 并开始死亡, 在感染后5d 内感染的泥鳅全部发生死亡(表1) 。其中有3尾泥鳅在感染后1d 体表充血发红, 在3d 时出现出血点, 感染后5d 腹腔注射部位周围发生较大溃疡, 随后发生死亡。对所有刚发生死亡的鱼进行细菌分离, 从中均又重新分离到了感

理生化特性测定, 可见菌株NQ 为革兰氏阴性; 杆状; 有运动性; 液化明胶; 精氨酸双水解酶阳性, 鸟氨酸脱羧酶阴性; 氧化酶、接触酶和吲哚阳性; 发酵葡萄糖产酸产气; 发酵麦芽糖、蔗糖和甘露醇; 不产硫化氢; 不能利用丙二酸为唯一碳源; 不能利用乳糖、肌醇和山梨醇;V. P. 试验阳性; 不水解七叶苷; 水杨苷产酸、甲基红和脲酶阴性。参照伯杰氏鉴定细菌学手册〔4〕、常见细菌系统鉴定手册〔5〕、兽医微生物学〔6〕、鱼类和其他水生生物细菌实用鉴定手册〔7〕, 发现除硫化氢产生这一项不一致外, 菌株NQ 的其余生理生化特性均与凡隆气单胞菌温和生物型(A. veronii biovar sobria ) 符合。

2. 5. 2　A PI ID 32E 鉴定条的鉴定结果　对菌株NQ 的鉴定, A PI 鉴定系统采用人工判读和A TB Exp ress 仪自动判读两种方式给出的结果均为温和气单胞菌(A eromonas sobri a ) 。2. 5. 3　16S rDNA 序列分析不包括引物结合区, 所扩增的NQ 菌株16S rDNA 的序列长度为1453bp 。将该序列在GenBank 上进行Blast , 发现其与气单胞菌属的16S rDNA 序列同源性非常高, 在相近的100个序列中, 除了有未培养的细菌外, 其他均为气单胞菌属的细菌。在这些气单胞菌属的细菌中, 排在前面的均为凡隆气单胞菌(A. veronii ) 。选取与NQ 菌株16S rDNA 序列同源性较高的16株气单胞菌属细菌以及2株亲缘关系相近的弧菌属的细菌来构建系统发育树, 所构建的系统发育树见图1。3　讨　论　　人工感染试验表明, 菌株NQ 能使健康泥鳅致病死亡, 并表现出与自然发病状态下相似的临床特征, 而且又从发病泥鳅中重新分离到了菌株NQ , 从而证实菌株NQ 为该养殖场泥鳅发病的病原。　　根据对菌株NQ 进行的生理生化的测试结果, 并参考伯杰氏鉴定细菌学手册等文献〔427〕所提供的

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图1　基于16S rDNA Fig. 1　带来的经济损失。　　目前, 凡隆气单胞菌感染的危害性越来越被人们所认识, 它不仅危害水产养殖的发展, 而且危害人类的健康, 已成为一种新的人兽共患病。该菌广泛分布于水体中, 夏秋高温季节繁殖较快, 如果此时养殖业者不注重养殖水体健康管理, 导致水质恶化, 再加上养殖生物抵抗力下降, 体表受伤等原因, 都会给凡隆气单胞菌的入侵感染以可乘之机。如果家畜饮用了凡隆气单胞菌污染的水体, , 就会大大增加, , 以防止凡隆气单, 减少人兽感染的机会。参考文献:

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收稿日期:2008205212; 修回日期:2008208219

, 从而初步鉴定菌株NQ 应为凡隆气单胞菌温和生物型。以菌株NQ 与其他相关菌属的16S rDNA 序列所构建的系统发育树显示:该菌与凡隆气单胞菌聚类, 这说明菌株NQ 与凡隆气单胞菌亲缘关系最近。因此综合生理生化特征和16S rDNA 序列分析的结果, 将菌株NQ 鉴定为凡隆气单胞菌温和生物型。

　　A. veronii 在医学上称维罗纳气单胞菌、维隆

〔6〕

气单胞菌, 兽医上常译作凡隆气单胞菌, 属于气单胞菌属。目前临床上关于凡隆气单胞菌感染的报道逐渐增多。侯天文等〔8〕在一位患慢性支气管炎的老年人急性发作时的痰中检出该菌; Mencacci 等〔9〕报道凡隆气单胞菌感染导致一位乙肝患者出现败血症和急性化脓性胆管炎; 不仅如此, 凡隆气单胞菌感染还导致一女孩肌肉剧烈疼痛, 血管内弥散性气栓生成, 最终死亡〔10〕; 一位患糖尿病和急性粒细胞白血病的老人因该菌感染出现了坏死性筋膜炎〔11〕; 此外, 还在一位发生腹泻的胃肠间质瘤患者体内同样发现了凡隆气单胞菌〔12〕。尽管从已报道病例来看, 该菌多在人体健康状况下降、免疫力低下时造成一些继发性的感染, 但是凡隆气单胞已成为危害人类健康的病原菌之一。　　凡隆气单胞菌除了能感染人类外, 在水产养殖上也逐渐成为危害性较大的病原菌。该菌曾引发孟加拉国鱼类的流行性溃疡综合症〔13〕。在国内, 该菌感染能使丁鱥〔14〕、罗非鱼〔15〕以及中华绒螯蟹〔16〕等水产动物患病, 给养殖业者带来较大的经济损失。本次在东海一家养殖厂所发生的泥鳅疾病, 经研究发现也是由凡隆气单胞菌感染所致, 感染导致高达60%的泥鳅死亡率。所以对于凡隆气单胞菌对水产养殖动物的危害我们也应该加以重视, 避免感染所