快速检验玉米种子纯度的方法
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学术园地
doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.012
石慧玲 杜德山 徐 晶 张 静 张文超
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(1 山东天泰种业有限公司 济南 250100 2 山东省平邑县农业局 3 潍坊科技学院)
摘 要 本文主要是对目前发展较为成熟和有较大发展前景的快速测定玉米种子纯度的方法,进行比较和评价。苗期标记性状在种子纯度检验上的优越性被深入研究;蛋白质电泳法因表达稳定、容易操作被广泛应用;SSR分子标记测定法随着分子标记技术的发展被不断完善;计算机智能识别技术测定种子纯度具有快速性和准确性,也具有非常大的应用潜力。未来玉米种子纯度鉴定的方法会向着更加直接、快速、准确的方向发展,以适应现代种子市场发展的要求。
关键词 玉米 纯度 分子标记 电泳
在种子收贮、调运、销售过程中,普遍存在种子纯度检验慢、种植检验时间长、田检成本高等问题,不能及时鉴别种子的等级、伪劣。所以,在种子收购调拨检验中,需有快速准确的纯度鉴定方法。下面就介绍几种目前发展较为成熟或者在未来有较大发展前景的比较快速准确的玉米种子纯度检验方法。
1 形态鉴别法
1.1 籽粒形态鉴别法
籽粒形态鉴别法主要是依据玉米的花粉直感、胚乳当代显隐性等遗传理论,通过种子的外部形态特征的差异来确定杂交种纯度。种子形态特征包括粒型、胚乳色、胚乳蛋白质层颜色、果种皮颜色、胚形等。如黄早四类型籽粒浅黄透明等性状由隐性基因控制,以它为母本与由显性基因控制的深黄色型的籽粒作为父本杂交,F0代种子由于花粉直感现象,籽粒变为黄色或深黄色,透明度差,无白顶现象。这种方法简单易行,在种子调运过程中需做出快速判断时要采用较多的方法,但是品种间形态差异较小、其形态特征同时受种子成熟度及其他环境条件的影响,并且操作者必须熟悉掌握一代种及其亲本种子在外部形态上的差异,主观性较强,准确性不高,除对于一些特定品种具有一定的利用价值,目前在种子纯度检测上已很少使用。1.2 苗期标记性状法
苗期标记性状是指在作物的幼苗阶段就能够明显识别的外观形态性状,比如叶色、叶形、花色、花冠、株型、开花期、角果等性状,其具有直观易见的特点。目前苗期标记形状应用主要分为两种:单基因控制的隐性性状和单基因控制的显性性状。单基因控制的隐性性状应用于杂交品种的母本,在F1种子的苗期,该性状消失的即鉴定为真
杂种,不消失的就是非杂种或母本株。另外,在母本繁殖时,苗期发现不表现母本标记性状的单株就是混杂株,可及时拔除以保证母本纯度;单基因控制的显性性状应用时作杂交品种的父本,在F1种子苗期表现该性状的即鉴定为真杂种,不表现的就是非杂种或母本株。另外,苗期发现表现父本标记性状的单株就是混杂株,可及时拔除以保证母本纯度。
利用苗期标记性状进行作物杂种一代新品种选育和种子纯度鉴定,能在苗期通过观察标记性状的存在或消失与否来识别真假杂种,达到能及早识别剔除杂种或非杂种株、实现亲本和杂交种种子纯度双重排杂、大大降低杂交种子鉴定费用等目的。该技术直观准确,简便快速,具有一般的异地种植鉴定、同工酶电泳鉴定和DNA分子标记鉴定技术无法比拟的优越性。目前在水稻、玉米、棉花、油菜、番茄、辣椒、黄瓜、胡萝卜、西瓜等作物上均有成功的应用报道,将可能成为我国未来作物育种和种子纯度鉴定技术的发展方向。
2 电泳鉴别法
电泳法主要是测定品种的蛋白质或者同工酶的差异,具有快速、准确性高、重复性好的优点。在同工酶电泳法中,由于同工酶往往具有组织或者器官的差异性,并且不同生长时期数量也不同,酶的提取以及电泳条件较为严格,所以实际操作中并没有得到很大范围的推广,目前在大部分种子企业和科研单位普遍采用的是蛋白质电泳法。
玉米种子贮藏蛋白质作为识别品种间遗传差异的重要生化标记,具有遗传差异表达稳定、多态性丰富和提取容易等特点,成为目前电泳法测定玉米种子纯度的主要手段。常用的蛋白质电泳法主要有超薄等电聚焦电泳
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(UTLIEF)、盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU-PAGE)。
超薄等电聚焦电泳技术跑出的谱带较为清晰,分辨率很高,耗时短,从样品制备到凝胶脱色只需要大约4h,并且一个胶板就可以鉴定104粒种子,省时省力,但是电泳所用的两性电解质价格较贵,进行纯度鉴定的成本较高;盐溶蛋白聚丙烯凝胶电泳法提取和染色所需要的时间较短,品种间谱带差异较为明显,互补带清晰并且分辨率高,包和平、曹丽娟等研究也表明,利用盐溶蛋白聚丙烯凝胶电泳法测定玉米种子纯度与田间种植试验的相关系数高达0.98,达到极显著水平,所以该方法因简单、经济、准确、快速的特点,被种业界广泛接受。但这个方法对亲本为姊妹系、多环系、改良系等遗传基础较为复杂的杂交种、亲本与杂交种谱带相似的单交种及正反交种却无法准确鉴别,而且这种方法所需试剂的配制也较为复杂。目前大部分种子公司用醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定玉米种子的纯度,与PAGE法相比,溶液的配制变得简单,不再需要用缓冲液配制分离胶和浓缩胶,简化了操作步骤,并且其样品提取和电泳时间都比较短,但是这种方法也有它的局限性,例如谱带弯曲、界限不太清晰等。
位和种群进化及遗传多样性研究,在玉米种子纯度测定方面的研究也越来越多,被认为是用于玉米品种纯度鉴定的最可靠且实用的分子标记技术。
4 计算机智能识别技术
目前在种子市场上尚无专门进行玉米种子纯度识别的仪器设备,只能靠传统的种子形态鉴定法:利用卡尺、天平等进行手工测量和主观判断,依赖检测员的经验,准确性和应用范围有很大的局限性。据报道,美国依阿华州立大学种子科学中心已成功开发出用于品种鉴定的计算机图像分析系统。预先将标准品种的种子、幼苗和植株形态特征以及电泳图谱信息输入计算机,建立图像库。在鉴定未知品种纯度时,将种子、幼苗、植株相关信息输入计算机与标准图象比较后,就可以鉴定品种纯度。这种方法可以在种子流通过程中比较快速的测定出种子的纯度,并且避免了检验员肉眼观察籽粒和幼苗形态时的主观性,比较准确,虽然使用该种方法的研究目前还比较少,专业、权威的图片库的建立也还需要一段时间,但是基于这种自动化技术的快速性和准确性,在以后的实践操作中将有更大的发挥空间。
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(收稿日期:2013—12—29)(本栏责任编辑:刘中漱)
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3 分子标记测定法
我国玉米的亲本自交系比较集中,导致了种质基础日趋狭窄,品种间某些性状区别较小,传统的方法对于一些特定的品种不能准确有效的鉴别,基于DNA指纹图谱的分子标记鉴定法由于直接测定的是品种的DNA差异,可以很好地解决这一问题。另外,基于分子标记测定法的准确性、稳定性及可重复性等优点,在未来有很大的发展空间。目前,可以用于玉米种子纯度鉴定的分子标记测定法主要有以PCR扩增为基础的SSR(简单重复序列)、AFLP(扩增片段长度多态)、RAPD(随机扩增多态性DNA)和以杂交为基础的RFLP(限制性片断长度多态性)。
RFLP、SSR和AFLP,大多是共显性标记,可区分纯合和杂合型。其中由于分子杂交的RFLP分析需要的总DNA多,检测过程复杂,而且费用大,难以在育种实践中推广应用;RAPD需要DNA量少,分析程序简单,多态性好,成本较低,在种子纯度鉴定方面的研究也较多,但大多是显性标记,不能区分纯合和杂合型,且重演性差,在实际应用中也存在一定的局限。不过有研究指出具有高质量的DNA、稳定的PCR反应条件、稳定的程序、适宜的引物以及在整个过程中设置重复,就能获得理想的纯度鉴定结果。AFLP的优点是多态性好,准确性高,灵活性强,但它的分析程序较复杂,而且成本较高,一般的育种单位难以接受;SSR则结合了前面三种方法的优点,需要DNA量较少,具有共显性、多态性丰富、重复性强、操作简便以及成本相对较低等特点,目前SSR已被广泛用于基因定