代谢组学及其研究方法和应用
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代谢组学及其研究方法和应用
陈慧梅 综述 刘志红 审校
关键词 代谢组学 核磁共振 质谱 代谢产物
代谢组学是继基因组学、[1]
学之后,系统生物学的重要组成领域的研究可以追溯至上年,Nicholson()技术分析大鼠的尿液,[2]
突破,并于1999,提出了代谢组学(metabonom2ics)的概念。代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中,所有代谢组分的集合,尤其指小分子物质”,而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。
细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物则更多地反映了细胞所处的环境,如营养状态,药物和环境污染等影响。正如BillyDavid所言:“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什
[3]
么”。其具体的内容:
11基因组学研究的是生物体在一定的病理生理条件下,基因表达谱的改变。但“沉默基因”及基因之间的互相调控,使得基因的“开”、“关”与生物学效应并无直接联系。而且不能与生物体作用的靶位点直接联系。
21蛋白质组学主要是针对细胞蛋白质的变化,进行半定量测定。蛋白质是生理功能的执行者,研究它可以很大程度地揭示病理生理机制,发现疾病的生物标志。但蛋白质组学也存在信号通路蛋白相互影响,靶位点难以定位等缺点,而且不能动态、实时的反映整体信息。
31代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产
[作者单位]南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所
(MW
代谢组学研究的技术平台包括以下几个部分:前期的样品制备,中期的代谢产物检测、分析与鉴定以及后期的数据分析与模型建立。
前期 代谢组学研究常用的检测技术,一般不需要对标本行特别的分离、纯化等。但离体条件下,细胞或组织内的代谢状态可迅速改变,代谢物的质与量亦随之变化,为正确反映在体的真实信息,须立即阻断内在酶的活性。最为常用的是冰冻/液氮降温法及冷冻、干燥的保存技术,尽管如此,细胞间仍始终有一低水平的代谢活动,需尽量避免氧化等活化因素。
中期 代谢产物的检测、分析与鉴定是代谢组学技术的核心部分,最常用的是NMR及质谱(MS)两种。
核磁共振技术 是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术,生命
113
科学领域中常用的是氢谱(HNMR)、碳谱(C
31
NMR)及磷谱(PNMR)三种。可用于体液或组织提取液和活体分析两大类。
1
常用的是体液分析研究。以氢谱(HNMR)为[5]
例,将准备好的生物标本(包括各种体液或组织
1
提取液),直接上样检测即可。所得的HNMR谱峰与样品中各化合物的氢原子对应,根据一定的规则或与标准氢谱比照可以直接鉴定出代谢物的化学成分,信号的相对强弱则反映了各成分的相对含量
[4]
(南京,210002)
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(图1)。不同样品的代谢物图谱有其特质性,类似
样品的“指纹”一样;对这种特质性进行区分、鉴定,
被称为“代谢指纹分析(metabolicfingerprintanaly2sis)”,帮助找出机体代谢的共性与个性
。
进一步的检测分析可以部分鉴定出化学成分以及半
定量关系。不同组别的质谱图存在差异(“代谢指纹”分析),加以区别、鉴定,亦有助于研究代谢的变化规律及标志性代谢产物
。
图2 正常尿液质谱分析图
NMR技术与MS技术相比,各有其优缺点,需要
图1 (NR)技术检测不同组织的谱图
A 肾乳头组织;B 肾皮质组织 两组间各自的特征性波明显
不同的差别
NMR还能够对活体内外的非损伤组织、器官进
在研究中灵活选用。总体而言,NMR技术应用的更
为广泛。此外,根据代谢组学的研究需要,还常用于其他的一些分析技术,如气相色谱(GC),高效液相色谱仪(HPLC),高效毛细管电泳(HPCE)等。它们往往与NMR或MS技术联用,进一步增加其灵敏性。但不容忽视的是,随着分析手段更新,敏感性及分辨率提高,“假阳性”的概率也就越大,可能是仪器技术方法固有的,亦或是数据分析过程中产生的。
后期 代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台。它往往借助于一定的软件,联合多种数据分析技术,将多维、分散的数据进行总结、分类及判别分析,发现数据间的定性、定量关系,解读数据中蕴藏的生物学意义,阐述其与机体代谢的关系。如果说分析技术在我们面前打开了“一扇门”,正确的数据分析方
[8]
法和模型建立便是“找到宝藏”的钥匙。
[9]
PCA)是最常用的分析方法。其将分散于一组变量上的信息集中于几个综合指标(PC)上,如糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等,利用主成分描述机体代谢的变化情况,发挥了降维分析的作用,避免淹没于大量数据中(图3)。其他的模式识别技术,如聚类分析、辨别式功能分析、最小二乘法投影法等在代谢组学研究中亦有其重要的地位。现实情况下,代谢组学的数据更为复杂,特别是NMR对病理生理过程的研究,将代谢物的表达谱与时间相联系,分析时更加困难,需要借助复杂的模型或是专家系统进行分析(在应用的部分,结合具体研究简单加以阐述)。已有研究小组建立了包括酵母糖酵解在内的一系列代谢模型,并在仿真器上开展代谢仿真等研究工作。
行研究。以心脏的磷谱研究为例,将预处理的体外灌流心脏直接置于检测区,持续观察低氧干预313+下PNMR谱峰的改变情况,发现低氧状况下,P
2+
和Mg的含量增加,并随低氧的延长而加深、加重。这种分析器官或组织中某一代谢物或组合随时间变化的情况,称之为“代谢轮廓分析(metabolicprofi2linganalysis)”,观察特定干预的动态系统中,找出机体代谢变化的规律。
NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点:①无损伤性,不破坏样品的结构和性质;②可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验;③与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律;④实验方法灵活多样。但仪器价格及维护费用昂贵限制了该技术的进一步普及。
质谱技术 是将离子化的原子、分子或是分子碎片按质量或是质荷比(m/e)大小顺序排列成图谱,并在此基础上,进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。新的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有很大程度的提高。
将预处理的体液或是组织(根据实验需要,可将组织行甲醇除蛋白、庚烷除脂肪及冻干等处理),加至质谱仪,经历汽化,离子化、加速分离及检测分析后即可得出相应代谢产物或是代谢组的图谱(图
[7]
2)。图谱中每个峰值对应着相应的分子量,结合
[6]
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羧酸的代谢产物也不同,可能与肾脏酸碱调节的改
变有关。
尿中代谢产物的组成变化还与个体间的健康状况、遗传差异性等密切相关。
外源因素 平,。wa等研究,,1
(HNMR)谱,:白天尿中的牛、马尿酸、肌酐水平较高,而葡萄糖、琥珀酸、二甲基甘氨酸、肌酸等相应较低。
饮食对尿、血的代谢谱均有着显著影响。
[16]
Phipps等利用NMR分析尿液发现,饮食状态不同,其中的马尿酸、氯原酸等代谢产物的量也随之改变;而食物种类的差异,也可影响这两条代谢通路的平衡。Honglian研究则发现,仅食物中libitum量不同,血清中NMR谱即可出现显著差异,它可以反映在多达56种已知的代谢产物上。临床研究中,亦证实了血清“代谢图谱”随着饮食不同发生规律性改
[18]
变。温度、觉醒等刺激,甚至周围气候不同、菌群的改变(图4),代谢组也可发生种类及数量的差别
。
[15]
图3 代谢主成分(PCA)分析示意图
根据不同种的核磁共振代谢数据,从中计算出成分1、2及标本的加权值,在此基础上,对所测标本进行有效地分类和鉴定
代谢组学在医学研究中的应用
生理条件下的变化特点 建立生理条件下对代谢谱的正确认识,是研究各种病理条件或刺激干预的前提。目前运用NMR技术对生理状态的研究已取得了一些进展。
内在因素 Jones
[10]
研究发现,灵长类、啮齿类
及兔类尿甘氨酸的量差别较大,反映了物种间葡萄
[11]1
糖醛酸化通路的差异。Bollard等利用氢谱(HNMR)分析B6C3F1小鼠和SD大鼠的尿液,前者的
尿酸、甲酸、肌酐、延胡索酸、22酮戊二酸、柠檬酸明显增加,而牛磺酸、内铵盐则较之为低。
尿液的NMR谱分析,可以快速、高效的检测品系差异导致的肝、肾等代谢酶活性的不同。如两种白化的小鼠及三种大鼠间(HanWistar,Gunn及SD)的色氨酸代谢不同,不同种的雄性小鼠对氯仿
肾毒性及镉肝毒性的易感性也不同
[12]
。
[13]
性别不同在代谢谱上也有反映。Stanley对
HW大鼠尿NMR谱分析发现,雄性波峰的变异性明
图4 改变饲养条件菌群环境,小鼠尿液核磁共振
(NMR)谱随时间变化图
将无菌培育的同种小鼠,放置于特定细菌环境下,随时间不同,尿液NMR谱出现规律性变化
显高于雌性,而前者对药物及毒物的敏感性也高。研究也证实,这种性别的差异一定程度上与激素水平的差异相关。
年龄也是一个影响因素。在四氯化碳的肝毒性模型研究中,Rikans等
[14]
疾病状态诊断 从代谢物角度审视问题,是利用代谢组学探讨疾病诊断及发病机制的最大优势。现有的研究大多仍是借助NMR的分析技术。
研究发现28月龄的F344
大鼠较5月龄的敏感性差;并随年龄增长,尿液中三
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诊断先天性疾病,既往主要依赖酶学检测,但耗
[19]
时、耗力,检出率低。如多种羧酶缺陷病,常规酶学检查不仅阳性率低,而且不能辨别治疗后微量酶变化。GC/MS解决了这一问题:它能够同时分辨32羟基异戊酸、32甲基巴豆酰甘氨酸微量变化,用于快速诊断、指导治疗;方便、快捷的检查羊水中32羟基异戊酸和甲基枸橼酸,适用于产前筛查。NMR检测不需要样品准备、提纯等预处理,用于疾病筛查更方便。如尿黑尿酸病,早在300综合征报道,但机制一直不明分析患者尿液,,,彻底分解为延乙酸,使得中间产物———并从尿中排出,进一步研究证实这是一种常染色体隐性遗传性代谢性疾病。肾脏疾病研究方面也有零星报道,包括慢性肾功能衰竭,肾小球肾炎,多囊肾,肾移植预后判定等。研究主要集中于NMR技术,比较尿液及血液中的代谢组成与变化情况,界定疾病状态和性质。
肿瘤,特别是无症状的早期肿瘤,尤其需要借助于敏感性高的综合检测手段。早在1992年,How2
[21]1
ells等便利用核磁共振(HNMR)技术联合主成分分析(PCA)对脑肿瘤组织进行检测,其中脑膜瘤诊断的准确率达85%,神经胶质瘤则为62%。Moka等对肾组织活检的标本进行NMR检测,发现即使是肿瘤未累及的组织部分,肾细胞癌的检出率也非常高,但该法不能区分原发灶和转移灶。
冠心病(CHD)的发病率逐年上升,虽然目前通用的X线血管造影法确诊率高,但创伤大、花费高、
[22]
副作用多。Brindle等将X线血管造影明确诊断的患者进行分组,同时用NMR技术分析血清样本,建立了合适的模型。借助此模型,对于可疑CHD患者诊断的灵敏度高达92%,特异性为93%(图5)。该模型还可能判别CHD轻、中、重的严重程度和累及血管的数目,甚至可以细分出轻2中、中2重及轻2重等亚型。目前正在进行大型的MAGICAD(www.med.cam.ac.uk/magicad)临床研究,试图用循证医学方法证实此法诊断的可行性(预计研究2000例,已完成了800例)。
此外,NMR技术正在探索应用于其他的体液检测及疾病诊断中。如分析糖尿病患者尿液及血液,发现糖尿病患者血浆中酮体、葡萄糖水平明显增加
,
[20]
■冠心病 ●非冠心病
图5 冠心病或非冠心病的患者血清核磁共振(NMR)检测分析图
胰岛素降解和血脂代谢的异常;目前尚无其他的非
创伤性检查手段,可以如此方便、快捷地同时检测酮体、葡萄糖、脂质及其他重要的生物标志。核磁共振113
(H及CNMR)检测关节腔内的滑膜液,有助于骨关节炎、类风湿性关节炎及创伤性关节炎的鉴别诊断。NMR对于脑积液的检测正被用于药物过量监测及脑病合并内脏脂肪变性(Reye)综合征和早老
[23]1
性痴呆(Alzheimer)病的诊断上。HNMR对精液的分析,可以帮助诊断输精管梗阻导致精囊的闭塞以及非梗阻性不育症。
药物安全性评价 代谢组学研究大大缩短了新药安全性研究的周期,它能够快速、有效地分析多条代谢通路,帮助定位靶组织及判定毒副作用程度,寻找相应的生物学标志。主要采用的仍是NMR技术,包括对各种体液、组织或组织提取液进行分析;在计算机基础上,发展起来的数据分析模型更是发挥了巨大的推动作用。美国食品与药品管理局(FDA)已经接受代谢组学研究的结果作为新药申报和注册的重要参考指标。
[25]
1989年,Gartland等根据药物造成的靶器官
1
(如肝、肾皮层或髓质毒)损伤及程度分组,利用HNMR对尿液进行分析,结合主成分分析(PCA),建立相应的毒理学研究模型,帮助判断新药的毒副作
[26]
用与程度,以及量效与时效关系。Holmes等研究了HgCl2(损伤近端肾小管)和乙基溴(损伤肾髓质)两组肾损伤模型,观察了9天HNMR谱的演变情况。在肾损伤进展及恢复的过程中,尿中20种代谢物发生的改变,与组织学的改变相一致,并存在规
1
[24]
・63・
谢组学最终是要将研究的触角涉及每一个代谢组
分,研究其共性、特性及规律,现有的研究离这一目标还很远。而且,代谢状态变化之迅速,影响因素之多,都给个体化研究带来很大的困难。我们也必须清楚地认识到,基因表达、,这也是系,还。
参
考
文
献
律性的时效关系。进一步相关分析的基础上发现,HgCl2的损伤是单一的直接损伤、具有可逆性;而乙基溴则为双重损伤机制(直接损伤加上影响渗透压而造成肾乳头的间接损伤)、可逆性差。肝毒性研究方面亦有相类似的研究。
“神经网络模式”和“随机神经网络模型”的发展,大大加速了代谢组学在新药安全性评价中的应用。借助于相应软件,将大量有标志(如正常对照、肝毒性、肾毒性等)分析,构成多因素数据网络模型;品,[27]
,等利用NMR,、肾和睾丸毒性的“神经网络模型,对同时测定的18种代谢产物进行评分,对新药损伤进行有效的预测和定位。Holmes等也在NMR分析尿液的基础上,建立了“随
1 GoodacreR.Makingsenseofthemetabolomeusingevolutionarycom2putation:seeingthewoodwiththetrees.JExpBot,2004,0:4312 NicholsonJK,TimbrellJA,SadlerPJ.ProtonNMRspectraofurice
asindicatorsofrenaldamage:mercurynephrotoxicityinrats.MolPharamacol,1985,27:644
3 GermanJB,BaumanDE,BurrinDG,etal.Metabolomicsintheo2peningdecadeofthe21stcentury:buildingtheroadstoindividual2izedhealth.JNutr,2004,134(10):2729
4 DouglasBK.Metabolomicsandsystemsbiology:makingsenseofthe
soup.CurOpininMicrobiology,2004,7:296
5 ChengLL,LenanCL,BogdanovaA,etal.Enhancedresolutionof
protonNMRspectraofmalignantlymphnodesusingmagicanglespin2ning.MagResMed,1996,36:653
6 闫永彬,罗雪春,张月清.大鼠离体心脏缺血预处理的核磁共振
机神经网络模型”,同时分析了1310种代谢产物的变化情况,剔除无用信息后,分离出727种作为检测对象,建立了正常及4个毒性作用的网络模型(肝、肾、肝肾联合及线粒体),以及不同鼠类的模型(HW和SD大鼠)。借用此模型,候选药物毒性作用判定及定位的有效率高达90%。与主成分分析(PCA)相比,“随机神经网络”模型的准确率要高得多,并且对小样本的分析结果也更为稳定。
[28]
Coen等在乙酰氨基酚的肝脏毒性研究中,有机结合了代谢组学与转录组学。利用基因芯片对肝组织中基因表达谱进行分析,同时采用NMR对肝组织、组织提取液和血浆进行分析。代谢组学研究的数据表明:肝组织提取液中糖和糖原减少、丙氨酸和乳酸盐增加,血浆中糖、醋酸盐、丙酮酸及乳酸盐则增加,提示糖酵解增加。这一结果与脂质和能量代谢相关基因的表达谱改变相一致,提示乙酰氨基酚毒性的影响在基因和代谢层面上存在高度的统一性。
代谢组学正处于快速发展的阶段,日益成为研究的热点。高通量、高分辨率的分析技术,与生物信息学相整合,对生物代谢层面进行研究,提供了了解生物体的独特视角。也必将在药物开发、临床诊断
[29]
和预防及营养科学等方面发挥越来越大的作用。
代谢组学的研究侧重于寻找相关特定组分的共性加以分析、判断,使诊断、治疗力求个体化,如何把握个体及小样本群体的特质是今后努力的方向。代
研究.清华大学学报.2000,40(11):9
7 PaulH,GamacheDF,MeyerMC,etal.Metabolomicapplicationsof
electrochemistry/massspectrometry.2004,15:1717
8 RobertsonDG,ReilyMD,LindonJC,etal.Metabonomictechnology
asatoolforrapidthroughputinvivotoxicityscreening.CompreToxi,2002,14:583
9 WatersNJ,HolmesE,WarterfieldCJ,etal.NMRandpatternrec2ognitionstudiesonliverextractsandintactliversfromratstreatedwitha2naphthylisonthiocyanate.BiochemPharmacol,2002,64:6710JonesAR.Someobservationsontheurinaryexcretionofglycinecon2
jugatesbylaboratoryanimals.Xenobiotica1982,12:387
11BollardME,KeunH,EbbelsT,etal.Comparativemetabonomicsof
differentialspeciestoxicityofhydrazineintheratandmouse.Toxi2col,2005,inpress.
12CostaC,DeAntoniA,BaccichettiF,etal.Metabolitesandenzyme
activitiesinvolvedintryptophanmetabolismintwostrainsofmouse.ItalJBiochem,1984,33(5):31913StanleyEG.
1
JAmSocMassSpectrom,
HNMRspectroscopicandchemometricstudiesonen2
dogenousphysiologicalvariationinrats.PhDthesis,UniversityofLondon,2002,43.
14RikansLE,HornbrookKR,CaiY.Carbontetrachloridehepatotoxici2
tyasafunctionofageinfemaleFischer344rats.Mech.Ageing
・64・
Dev,1994,76(223):89
15KishikawaT,TakahashiH,ShimazawaE,etal.Diurnalchangesin
calciumandphosphatemetabolisminrats.HormMetabRes,1980,12:545
16PhippsAN,StewartJ,WrightB,etal.Effectofdietontheurinary
excretionofhippuricacidandotherdietary2derivedaromaticsinrat.Acomplexinteractionbetweendiet,gutmicrofloraandsubstratespe2cificity.Xenobiotica,1998,28(5):527
17HonglianS,Vigneau2CallahanKE,ShestopalovAI,etal.Characteri2
sationofdiet2dependentmetabolicserotypes:primaryvalidationofmaleandfemaleserotypesinindependentcohortsofrats.J2002,132:1039
18ZuppiC,MessanaI,ForniF,etal.
1997,265(1):85
19宋元宗,吴本清,.GC2MS分
1
nosisofthepresenceandseverityofcoronaryheartdiseaseusingH212NMRbasedmetabonomics.NatureMedicine,2002,8:14392323LindomJC,NicholsonJK,HolmesE,etal.Theroleofmetabo2
nomicsintoxicologyanditsevaluationbytheCOMETproject.ToxiAppliPharm,2003,187:137
24RaamsdonkLM,TeusinkB,Bretal.Afunctionalge2
nomicsthatusestorevealthephenotypeof.Bi19:45
25,onJK,Investigationsintothebio2
region2specificnephrotoxins.MolPharm,1989,HolmesE,NicholsonJK,TranterG.Metabonomiccharacterizationof
ofgeneticvariationsintoxicologicalandmetabolicresponsesusingprob2abilisticneuralnetworks.ChemResToxi,2001,14:182
27AnthomyML,RoseVS,Nicholson,etal.Classificationoftoxinin2
ducedchangesin1HNMRspectraofurineusinganartificialneuralnetwork.PharmaceuticalBiomedicalAnalysis,1995,13:20528CoenM,LenzEM,NicholsonJK,etal.Anintegratedmetabonomic
investigationofacetaminophentoxicityinthemouseusingNMRspec2
1
rines:referencerangesorClinChimActa,
析.基础医学与临床,2004,24(2):213
20LindonJC,NicholsonJK,EverettJR.NMRspectroscopyofbioflu2
ids.AnnualReportsonNMRSpectroscopy,1999,38:1
21HoellsSL,MaxwellRJ,PeetAC,etal.AninvestigationoftumorH
nuclearmagneticresonancespectrabytheapplicationofchemometrictechniques.MagResMed,1992,28:214
22BrindleJT,AnttiH,HolmesE,etal.Rapidandnoninvasivediag2
troscopy.ChemResToxi,2003,16:295
[收稿日期]2005201218(本文编辑 丁大洪)