羊肚菌液体深层发酵条件
第26卷第2期食品与生物技术学报Vol.26 No.2 2007年3月Mar. 2007JournalofFoodScienceandBiotechnology文章编号:167321689(2007)0220080207
羊肚菌液体深层发酵条件
欧超, 王娣, 张兆轩, 李正鹏, 蔡永萍, 林毅
(安徽农业大学生命科学院,安徽合肥230036)
摘 要:以羊肚菌为材料,研究了发酵过程中碳源、氮源、无机盐、培养条件对菌丝体生物量、胞外
多糖的影响,以及发酵过程中菌丝体生物量、胞外多糖、总糖及还原糖质量浓度、培养基pH值的动态变化,并在此基础上确定了羊肚菌液体深层发酵的最佳条件。结果表明:的最优培养基配比为:玉米粉410g/dL、葡萄糖110g/dL、2103g/dL、KH2PO4012g/dL、MgSO4011g/dL、CaSO4011g/dL518,250mL的摇瓶装液量为100mL,接种量10mL,108h。关键词:羊肚菌;深层发酵;菌丝体生物量中图分类号:Q93
:A
FermentationTechnologyofMorchellaesculenta
OUChao, WANGDi, ZHANGZhao2xuan, LIZheng2peng, CAIYong2ping, LINYi
(SchoolofLifeScience,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)
Abstract:Theeffectofnutritionalandenviromentalconditionsonpolysaccharideproductionbymorchellaescutentainliquidfermentationweredetermined.Theoptimalresultswasasfollow:cornpowder410g/dL,glucose110g/dL,soybeanpowder210g/dL,yeastextract013g/dL,KH2PO4012g/dL,MgSO4011g/dL,CaSO4011g/dL,temperature24℃,initialpH518,liquidvolumes100mL/250mL,inoculationvolume10mL,shakingrate140r/min,fermentationtime108h.Key
words:
Morchellaesculenta;
liquidfermentation;mycelialbiomass;
extracellular
polysaccharide
羊肚菌(Morchellaesculenta),俗称羊肚蘑、羊肚菜、阳雀菌等,属子囊菌亚门(Ascomycotina),盘菌目(Pezizales),羊肚菌科(Morchellaceae),羊肚菌属(Morchella)[1]。羊肚菌营养丰富,其氨基酸含量为各食用菌之首。羊肚菌多糖是其主要药用成分
收稿日期:2006208226.
基金项目:安徽省政府人才基金项目(2003526)资助.
之一,具有增强肌体免疫力、促进副肾皮激素的分
泌、降低胆固醇、预防动脉硬化、抗疲劳、抗病毒、抑制肌癌2180等诸多作用[2-5]。由于在食用、药用等方面的重要价值,羊肚菌深受各国消费者的青睐,国内外市场一直很好。但因气候、海拔、温度、湿
作者简介:欧超(19832),男,安徽肥东人,遗传学硕士研究生.Email:[email protected]
通讯作者:林毅(19572),男,安徽金寨人,农学硕士,教授,博士生导师,主要从事生物技术、作物遗传育种研究.
Email:[email protected]
第2期欧超等:羊肚菌液体深层发酵条件81
度、土壤等环境因素的影响,其野生产量极低,且不能完全进行人工栽培,故价格十分昂贵[6-8]。
羊肚菌多糖可以通过深层发酵生产,具有菌丝体增殖快、产量大、生产周期短等优点,且不受环境因素的影响。以深层发酵获得的菌丝体和发酵液为原料提取羊肚菌多糖,可以显著降低成本,提高生产效率,适合工业化生产[9]。作者对羊肚菌的液体深层发酵工艺进行了初步研究,以期为羊肚菌的进一步开发提供科学依据。
的基础上,选用KH2PO4、MgSO4、CaSO4、ZnSO4,设计L9(34)正交试验,发酵条件相同,设3个重复,见表2。
表1 碳源、氮源正交试验设计表
Tab.1 Schemeofcarbonandnitrogensourcesinorthogonal
experiment
因素
水平
A玉米粉
B葡萄糖
C黄豆粉
D酵母粉
质量浓度/
(g/dL)
123
3154104质量浓度/(g/dL)
1101150
质量浓度/(g/dL)
11021质量浓度/(g/dL)
011012013
1 材料与方法
111 材料
11111 菌种 羊肚菌(Morchellaesculenta),由安
徽农业大学食用菌研究所提供。11112 培养基
1)斜面培养基(组分g/dL):马铃薯20,2,蛋白胨013,琼脂118,KH2PO14012)):,蛋
2 saltinorthogonalexperiment
因素
水平AKH2PO4BMgSO4
质量浓度/质量浓度/(g/dL)(g/dL)
123
[**************]
[**************]
CCaSO4
DZnSO4
白胨012,1411,2PO401046,K2HPO40113)(组分g/dL):葡萄糖4,蛋
质量浓度/
(g/dL)
[**************]
质量浓度/(g/dL)
[**************]
白胨015,KH2PO40115,MgSO401075。112 实验方法11211 摇瓶培养 从已活化的斜面上挑取两小块015cm的菌丝体,接入到装有100mL液体种子培
2
11215 液体发酵条件的优化 在确定最佳发酵培
养基成分的基础上,设计不同温度、pH值、装液量、接种量和转速,进行单因素试验,测定菌丝体生长量、胞外多糖质量浓度,从而确定最佳发酵条件,设3个重复,见表3。
表3 发酵条件优化设计表
Tab.3 Schemeofoptimizationforfermentationconditions
养基的250mL的三角瓶中,置于25℃的摇床上培养4～5d。按体积分数10%的接种量,将10mL摇瓶种子液接入到装有100mL发酵培养基的250mL的三角瓶中,25℃、150r/min条件下,摇瓶培养5d。112
12 碳源、氮源的单因素筛选试验
1)碳源筛选实验:在基础培养基中分别以4g/dL的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖、果糖代替
因素
水平
温度/℃pH值
123456
2022242628-4.55.05.56.06.57.0
装液量/
mL
[1**********]0-
接种量/mL
5101520--
转速/(r/min)
[**************]80
葡萄糖作为碳源;
2)氮源筛选实验:在基础培养基中分别以黄豆粉、酵母粉、麸皮、硝酸铵、氯化铵代替蛋白胨作为氮源,其添加量根据各自的全氮含量相对于015g/dL蛋白胨的全氮量折合而成。玉米粉、黄豆粉均需
煮沸取汁,其他条件与基础发酵培养基相同,设3个重复,进行摇瓶发酵。11213 碳源、氮源正交试验 根据碳、氮源的单因素筛选试验的结果,选择较好的碳源、氮源各2个,设计L9(34)正交试验,发酵条件与上述相同,设3个重复,见表1。11214 无机盐正交试验 在最佳碳、氮源培养基
11216 摇瓶发酵 按照筛选出来的发酵培养基和
发酵条件进行摇瓶发酵,在发酵过程中检测菌丝体生物量,胞外多糖、总糖及还原糖质量浓度,培养基pH值等。
82
113 测定方法
食 品 与 生 物 技 术 学 报 第26卷
11311 菌丝体生物量的测定 将发酵醪过滤,滤
液留用,所得菌丝体用蒸馏水反复洗涤,置于60℃干燥箱中烘干并称重[10]。11312 胞外多糖的测定 取30mL过滤所得的滤液,4500r/min下离心20min,取上清液加3倍体积(即90mL)的无水乙醇,置冰箱中24h后,再于4500r/min下离心20min,去上清液,沉淀溶于一
定量去离子水中稀释,用硫酸苯酚法测定胞外多糖含量[11]。11313 总糖及还原糖的测定
1)总糖测定:取滤液5mL,加入6mol/L的盐酸10mL,水5mL,沸水浴30min后,加入6mol/L的氢氧化钠溶液调pH至中性,稀释,定容,过滤,用3,52二硝基水杨酸法(DNS)测定[11]。
2)还原糖测定:取滤液10mL,再加水10摇匀后,50℃保温30min,定容,,用,52基水杨酸法(DNS)测定[11]11314 pH测。
图1 碳源对羊肚菌液体发酵的影响
Fig.1 Effectofcarbonsourcesonliquidfermentationof
Morchella
2 结果与分析
211 碳源对羊肚菌深层发酵的影响
图2 氮源对羊肚菌液体发酵的影响
Fig.2 Effectofnitrogensourcesonliquidfermentation
ofMorchella
由图1可知,6种碳源均可被羊肚菌菌丝体利
用,说明羊肚菌对碳源的要求并不苛刻,既能利用成分复杂的复合碳源,也能利用单糖和双糖等小分子碳源。其中以玉米粉和葡萄糖为碳源时,菌丝体生物量最高,其次为可溶性淀粉、麦芽糖和蔗糖,果糖最少;对胞外多糖而言,玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉最好,其次为蔗糖、麦芽糖和果糖。综合评比,玉米粉、葡萄糖和可溶性淀粉较好。但考虑到玉米粉价格低廉,且来源方便;同时葡萄糖作为一个速效碳源,可被菌体直接利用,能够缩短发酵延迟期。故选用玉米粉、葡萄糖作为正交试验的碳源。212 氮源对羊肚菌深层发酵的影响从图2可以看出,羊肚菌在含酵母粉、黄豆粉、蛋白胨、麸皮的培养基中均能很好生长,而在含氯化铵、硝酸铵的培养基中生长不良,说明羊肚菌对有机氮的利用比无机氮好。其中以酵母粉作为氮源时,菌丝体生物量和胞外多糖质量浓度均最高,黄豆粉次之。考虑到生产成本,黄豆粉来源方便,价格低廉,同时酵母粉作为生长因子有利于菌丝体的生长,缩短发酵周期。因此,选择黄豆粉和酵母粉作为氮源进行正交试验。
213 碳源、氮源正交试验的结果
由表4结果可以看出,不同组合之间发酵结果是不同的。由极差可知,对菌丝体生物量、胞外多糖质量浓度而言,极差顺序均为酵母粉质量浓度>玉米粉质量浓度>黄豆粉质量浓度>葡萄糖质量浓度。极差越大,效果就越好,这说明酵母粉质量浓度对发酵的影响最大,葡萄糖的则最小。以菌丝体生物量为指标进行衡量,应该选择A2B3C2D3;以胞外多糖质量浓度为指标进行衡量,应该选择A2B1C2D3。由于B(葡萄糖)的作用最小,故A2B3C2D3、A2B1C2D3相差不大,最终决定选择A2B1C2D3,即玉米粉410g/dL、葡萄糖110g/dL、黄豆粉210g/dL、酵母粉013g/dL。214 无机盐正交试验的结果
由表5可以看出,不同组合之间发酵结果是不同的。由极差分析可知,对菌丝体生物量而言,极差顺序为MgSO4质量浓度>KH2PO4质量浓度>CaSO4质量浓度>ZnSO4质量浓度;对胞外多糖质量浓度而言,极差顺序为KH2PO4质量浓度>Mg2SO4质量浓度>CaSO4质量浓度>ZnSO4质量浓度。极差越大,起的作用就越大,这说明在羊肚菌液体发酵过程中,MgSO4质量浓度对菌丝体生物量
第2期欧超等:羊肚菌液体深层发酵条件83
的影响最大,KH2PO4质量浓度对胞外多糖质量浓度的影响最大。以菌丝体生物量为指标进行衡量,应该选择A2B2C2D1;以胞外多糖质量浓度为指标进行衡量,该选择A2B2C1D1。由于C(CaSO4)的影
响较小,故A2B2C2D1、A2B2C1D1相差不大,最终决定选择无机盐的配比为:A2B2C1D1,即KH2PO4012g/dL,MgSO4011g/dL,CaSO4011g/dL。
表4 碳、氮源正交试验结果的极差分析
Tab.4 Resultsoforthogonalexperimentoncarbonandnitrogensources
序号
123456789
A(玉米粉)B(葡萄糖)C(黄豆粉)D(酵母粉)
菌丝体生物量/
(mg/mL)
7.804610.129710.084510.6212110.21249.3145
胞外多糖
质量浓度/(mg/mL)
0.81231.11921.21121.51220.93141.23511.21311.31010.9375
111222333
k12
1231231239.9410.4081.1791.1201.1280.059
123231329.48010.0229.8560.5421.1191.1901.1190.071
12331218.81010.24210.3061.4960.8941.1891.3450.451
菌丝体生物量/
(mg/mL)
9.0.7791.0481.2261.1540.178
多糖质量浓度/
(mg/mL)
k1k2k3R
表5 无机盐正交试验结果的极差分析
Tab.5 Resultsoforthogonalexperimentoninorganicsalt
序号
123456789
A(KH2PO4)B(MgSO4)C(CaSO4)D(ZnSO4)
菌丝体生物量/
(mg/mL)
10.212210.542310.121110.712411.122410.192110.321910.421
310.5187
胞外多糖
质量浓度/(mg/mL)
1.59421.54751.50211.70141.74121.65121.56221.67021.5421
111222333
k1k2k3R
[1**********].41510.69510.2770.4181.6191.6531.5650.088
[1**********].27510.59110.5220.3161.6391.5971.6020.042
[1**********].61810.35210.4180.2661.6261.5870.6250.039
菌丝体生物量/
(mg/mL)
10.29210.67610.4210.3841.5481.6981.5910.150
多糖质量浓度/
(mg/mL)
k1k2k3R
为120mL时,菌丝体生物量最高。可能是由于装液量太高时,虽然胞外多糖质量浓度较高,但单位
体积的得率反而减少。考虑到菌丝体生物量和胞外多糖的质量浓度,故装液量选择100mL
。
215 温度对羊肚菌深层发酵的影响
分别在20、22、24、26、28℃下培养,结果发现羊肚菌在20～28℃内均能生长,见图3。温度较低,生长较慢;在24～28℃时,羊肚菌菌丝体生长均较好,没有明显差别。24℃时胞外多糖得率最高,温度过高,胞外多糖质量浓度反而下降。因此,确定羊肚菌最佳培养温度为24℃
。
5图3 温度对羊肚菌深层发酵的影响
Fig.3 EffectoftemperatureonliquidMorchella
volumeonliquidfermenta2
ofMorchella
216 起始pH用1LHL调节发酵
培养基的pH,15,510,515,610,615,710。图4pH值的选择结果,pH515时可促进菌丝体的生长,pH610时有利于胞外多糖的生成,而发酵培养基的自然pH值偏酸,约为518,因此采用培养基的自然pH值518即可
。
图6 装液量对羊肚菌深层发酵的影响
Fig.6 Effectofliquidvolumesonliquidfermentationof
Morchella
219 摇床转数对羊肚菌深层发酵的影响
摇床转速对菌丝生长状态和菌丝球的形成有明显作用。转速小时,菌丝体趋于分散生长,有利
于形成更多新的生长点,但不利于通氧,因此菌丝体生长缓慢。转速较大时,通气量大,溶解氧增多,菌丝体生长量增多,菌球直径变小,胞外多糖产量也增加。当转速过快时,菌丝缠绕过密,形成球、块状,同样不利于菌丝体生长。从图7可以看出,当转速为160r/min时,菌丝体生物量最大,但胞外多糖得率在140r/min时达到最大。其原因可能是由于较高的转速导致发酵液流速较大,对成型的菌丝球产生的剪切力太大,从而导致胞外多糖的积累减少,故最终转速选择140r/min。2110 羊肚菌摇瓶发酵过程中的动态变化
按照筛选出来的发酵培养基和培养条件进行摇瓶发酵,每隔12h取样测定生物量,胞外多糖、总糖及还原糖质量浓度、培养基pH值。经过120h的发酵,得出以上几个参数的变化曲线,见图8～
图4 初始pH值对羊肚菌深层发酵的影响
Fig.4 EffectofinitialpHonliquidfermentationof
Morchella
217 接种量对羊肚菌深层发酵的影响
图5为接种量的选择结果。接种量为15、20
mL时,发酵前期菌丝体生长过于旺盛,培养基营养成分迅速消耗,导致发酵后期菌丝体生长缓慢,不利于代谢产物多糖的生成;而接种量为10mL时,对菌丝体和多糖有明显促进作用,故接种量选择10mL。218 装液量对羊肚菌深层发酵的影响
由图6可以看出,250mL的三角瓶中,装液量为100mL时,胞外多糖质量浓度最高;但在装液量
10。结果表明:0～48h为延滞期,48～96h为对数
期,以后进入稳定期和衰亡期。菌丝体生物量在108h达到峰值,在衰亡期开始自溶,生物量开始下降;胞外多糖质量浓度仍有增长的趋势,可能是菌丝体自溶后释放多糖到培养基中所致。pH值变化曲线为先降后升,但一直都保持在515～610之间,这一数值正是羊肚菌生长的适宜pH值的范围。从胞外多糖质量浓度的变化曲线可以看出,发酵液中总糖质量浓度在96h时达到最低,可以初步确定108h左右为发酵的终点时间
。
图10 摇瓶发酵过程中总糖和还原糖的变化曲线
Fig.10 Timecourseofsugarconcentrationintheliquid
fermentation
3 讨 既是菌丝体细胞结,。通过单因素试验,。特别是玉米粉,生产成本低且含有多种复合因子,营养成分丰富,能增加培养基的粘度,使菌丝球的直径较小,数量增多,加大其与培养基中营养物质和氧气的接触面积,有利于菌丝体的生长。玉米粉中的主要碳源成分是淀粉,只有在菌丝体分泌胞外酶的作用下降解后,才能被利用;而葡萄糖可缩短发酵延迟期,但其组分单一,不利于菌丝体在对数期的生长,其价格也较高,不适合大规模的工业生产,因此结合它们的特点,选用葡萄糖与玉米粉作为正交设计的碳源。
氮源是构成菌丝体氨基酸、蛋白质、核酸的重要物质,可分为有机氮和无机氮两类。大部分真菌都能很好地利用有机氮,而对无机氮的利用较差。
图8 摇瓶发酵过程中羊肚菌的生长曲线
Fig.8 Time2courseofMorchellagrowthintheliquid
fermentation
图7Fig.7 Effectrateonliquidfermentationof
Morchella
单因素试验证明,酵母粉和黄豆粉是很好的氮源。酵母粉对菌丝体的生长有促进作用,但作为生化试
剂,价格较高,因此在正交设计时仅作为辅助因子,加入少量即可。黄豆粉作为一种复合氮源,来源方便,价格低廉,故作为羊肚菌液体发酵的主要氮源。曾有文献报道酵母提取液会抑制羊肚菌的生长,但作者选用酵母粉作为生长因子,对羊肚菌的液体发酵有明显的促进作用。
真菌在深层培养中需要少量的无机盐和微量元素,有的是细胞的重要组成成分,有的在调节细胞膜透性和酶活性方面起重要的作用。结果表明,
图9 摇瓶发酵过程中pH变化曲线
Fig.9 Time2courseofpHintheliquid
fermentation
添加微量的锌盐对菌丝体生物量和胞外多糖的产
生反而有抑制作用,原因可能是在玉米粉和黄豆粉中已含有羊肚菌菌丝体生长所需的锌量。
对发酵条件的研究发现,羊肚菌生长的适宜
最低,同时由于菌丝体生物量在108h达到峰值,所以基本可以确定发酵终点时间在108h。
pH值在610左右。所配制的发酵培养基的pH为518,基本适应发酵要求。羊肚菌深层培养的最适
温度是24℃,比自然界中菌丝体生长的适宜温度
高出10℃左右。
摇瓶发酵的动态变化中,菌丝体生物量在108h达到峰值,即17134mg/mL,而在120h时胞外多糖质量浓度仍有增长趋势,可能是由于菌丝体自溶导致。若不考虑其他条件,预计1L发酵液可得17134g干菌丝体和1181g胞外多糖。当然在发酵罐中进行实际生产时,还可以进行补料分批发酵等方法的改进,而且还要综合考虑其他条件,所以在菌丝体和胞外多糖的产量上还有很大的提高空间。从发酵参数的变化来看,总糖质量浓度在96h达到
4 结 论
羊肚菌深层发酵的最佳碳源为玉米粉+葡萄糖,最佳氮源为黄豆粉+酵母粉。发酵的最优培养基组成为:玉米粉410g/dL,葡萄糖110g/dL,黄豆粉210g/dL,酵母粉013g/dL,KH2PO4012g/dL,MgSO4011g/dL,CaSO4011g/dL;最优培养条件为:24℃,起始pH518,100mL/250mL,接种量10mL,min,发酵时间
为108h参考文献(References):
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(责任编辑:李春丽)