实验五 底物浓度
实验五 底物浓度、酶浓度对酶促反应速度的影响
实验人：刘彦汶 学 号：[1**********] 班 级：针外2010七 同组人：严安、曲畅 实验日期：2012-4-25 指导老师：路雪雅
一、 实验目的
1、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验原理。 2、掌握酶浓度、底物浓度对碱性磷酸酶反应速度的影响的实验方法。
二、 实验原理
碱性磷酸酶可以催化水解底物分子的磷酸基团。本实验用大鼠肾脏碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，水解反应如下：
水解产物苯酚与酚试剂反应呈色，产物可以在660nm 波长下比色，以检测苯酚浓度，从而确定反应速度。 （一）
底物浓度对酶促反应速度的影响
当酶量不变时，增加底物浓度，在初期，反应速度显著增加，当底物浓度增加至一定量时，反应速度增加缓慢，继续增加底物浓度时，反应速度不再增加，这说明所有酶发挥了最大效用，底物的量已过剩。 将米氏方程两边取倒数所得到的双倒数方程式称林-贝氏方程：
1/V=(Km/Vmax ) ·1/[S]+1/Vmax
在林-贝氏方程中，1/V与1/[S]称线性关系。以1/V对1/[S]作图得到一条
直线，其斜率是Km/Vmax ，在纵轴上的截距为1/Vmax ，在横轴上的截距为-1/Km 。应用双倒数作图法可以求酶的Km 值。 （二）
酶浓度对酶促反应速度的影响
当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此时反应速度与酶浓度成正比，本实验可以帮助检查酶促反应条件的准确性和可行性。
三、 实验器材
试管、定量移液管、水浴锅、分光光度计
四、 实验试剂
PH 为10的缓冲液、3、6、12mmol/L底物液、（1:4000）酶液、酚试剂、0.5mol/L
碳酸钠
五、 操作步骤及结果
（一） 底物浓度对酶促反应速度的影响 按下表操作
以吸光度倒数为纵坐标，底物浓度倒数L/mmol为横坐标作图，求米氏常数 实验所作图如下
（二） 酶浓度对酶促反应速度的影响
度的关系 【附注】
1号试管是空白管不加酶液（在酶浓度试验中，应同时做相同的不同酶浓度的对照管，以校正酶液本身可能存在天然酚含量，但在本实验中，所用酶液中天然酚含量较小，可略去不计） 实验所作图如下
六、 结论及讨论
结论
1、 根据所作图，又由于吸光度A 反映的是酶促反应的速率的快慢，即A 与
反应速度成正比，由此可推知1/V与1/[S]称线性关系。以1/A对1/[S]作图得到一条直线，其在横轴上的截距为-1/Km 。应用双倒数作图法可以求酶的Km 值。由图可求出Km=0.20
2、 当底物浓度足够高时，在反应过程中底物的减少并不影响反应速度，此
时反应速度与酶浓度成正比。 讨论
1、 由于坐标纸不够充裕而使作图不够精确，最终使作图所求Km 值产生误
差。
2、 由于分光光度计本身的误差而使实验所得数据有一定的误差。