一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定

30(4)489-496 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2014年8月

一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定

郭芳芳1,2，谢 镇3，卢 鹏1，郭岩彬4，张立钦2，王勇军1,2*

（1. 浙江农林大学林业与生物技术学院，临安311300；2. 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，临安311300；3. 浙江省桐庐县林业局，

桐庐311500；4. 中国农业大学资源与环境学院，北京100193）

摘要：菌株CF05是从浙江天目山柳杉中分离得到的1株细菌，经形态、16S rDNA序列、生理生化指标检

测，鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa。平板拮抗结果表明，该菌对9种植物病原真菌和3种病原细菌具有显著拮抗效果。室内生测结果表明，发酵液和菌悬液对番茄幼苗均具有明显的促生效果，其中发酵液处理最佳，鲜重增长272.0%，干重增长266.7%。菌株CF05接种27 d后，番茄根际细菌浓度仍很高。种子萌发测定结果表明，菌株CF05处理后发芽率提高11.7%，番茄猝倒病防治测定结果显示，发病率降低38.6%，效果均优于Bacillus subtilis 168处理。综上结果，表明P. polymyxa CF05是1株生防性状优良的促生细菌。

关 键 词：多粘类芽孢杆菌；生物防治；促生；番茄猝倒病

中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2014)04-0489-08

Identification of a Novel Paenibacillus polymyxa Strain and Its Biocontrol

and Plant Growth-Promoting Effects

GUO Fangfang1,2, XIE Zhen3, LU Peng1, GUO Yanbin4, ZHANG Liqin2, WANG Yongjun1,2*

(1. College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide Preparation, Lin’an 311300, China; 3. Tonglu Forestry Bureau of Zhejiang Province, Tonglu

311500, China; 4. College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094, China)

Abstract: Strain CF05 isolated from Cryptomeria fortunei in Tianmu Mountain, Zhejiang province was identified as Paenibacillus polymyxa on the bases of its phenotypical and biochemical characteristics as well as 16S rDNA gene sequence. The P. polymyxa CF05 exhibited highly antagonistic effects against 9 plant fungal pathogens and 3 plant bacterial pathogens in vitro. Furthermore, both cell-free fermentation and bacterial suspension promoted tomato seedlings growth in greenhouse assay. Cell-free fermentation increased the biomass with fresh weight and dry weight by 272.0% and 266.7%, respectively. It was demonstrated that secondary metabolites from this bacterium might perform a critical function in plant growth promotion. Tests of root-colonizing ability indicated that concentrations of the bacterium in tomato rhizosphere were 3.8, 3.6, 3.1 and 3.1 log CFU/g root after 27 days of inoculation of tomato seeds with the bacterial suspension at 108、107、106、105 CFU/mL, respectively. Seed germination ratio was increased by 11.7%, and the disease incidence of damping-off was reduced by 38.6% after seed treatment.

Key words: Paenibacillus polymyxa; biological control; plant growth promotion; tomato damping-off disease

多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa是一类具有广泛宿主的根际促生菌，对真菌、细菌、线虫等引起的植物病害具有防治效果。Timmusk等[1]研究发现多粘类芽孢杆菌处理后，可在植物根际大量定殖，有

收稿日期：2013-09-15

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303106）；浙江省人事厅留学人员科技活动项目（2010RF084）

作者简介：郭芳芳（1988-），硕士研究生，E-mail：[email protected]；*通信作者，副教授，E-mail：[email protected]。

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效拮抗棕榈疫霉Phytophthora palmivora和瓜果腐霉Pythium aphanidermatum。Khan等[2]报道P. polymyxa GBR-1能抑制根结线虫卵孵化和毒杀幼虫，可有效减少番茄根结形成。Mageshwaran等[3]报道P. polymyxa HKA-15的代谢产物可以有效拮抗植物病原细菌Xanthomonas campestris pv. phaseoli。Ryu 等[4]报道在田间试验中芝麻种子经P. polymyxa E681包衣处理后，可以显著控制猝倒病，解决了芝麻连作的难题。

多粘类芽孢杆菌可产生多种抗生素[5,6]、多粘菌素[7]及各种水解酶[8]等拮抗物质，这些拮抗物质是多粘类芽孢杆菌发挥生物防治作用的重要机制之一。除此之外，多粘类芽孢杆菌能够诱导植物产生水杨酸，从而引发诱导性系统抗性（ISR）[9,10]。多粘类芽孢杆菌还可以合成植物生长素、细胞分裂素、胞外多糖，增强土壤通透性，具有溶磷、固氮的活性[11~13]。多粘类芽孢杆菌可定殖于植物的根际及土壤，为生防功能的表现奠定了基础[14,15]。

本研究从浙江天目山柳杉中分离获得了1株细菌CF05，通过菌株形态特征、16S rDNA序列分析及其生理生化反应，确定菌株CF05为1株多粘类芽孢杆菌，平板测定表现出对植物病原真菌和细菌明显的拮抗特征。本研究从离体拮抗、种子萌发、防病、促生、根际定殖稳定性等方面，初步测定了该细菌的促生及生防效果，探讨了其作为生防促生细菌的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

多粘类芽孢杆菌P. polymyxa CF05，P. polymyxa ATCC 842T，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168病原真菌水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae，水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani，小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis，番茄灰霉菌Botrytis cinerea，番茄早疫病菌Alternaria solani，棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum，瓜果腐霉P. aphanidermatum，西瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. niveum，百合根腐病菌F. oxysporum f. sp. lilii，病原细菌水稻白叶枯菌X. campestris pv. oryzae，白菜软腐病菌Dickeya dadantii，葡萄根癌菌Agrobacterium vitis，均为本实验室保存。 1.2 形态特征观测

牛肉膏蛋白胨固体培养基（nutrition agar，NA）培养细菌16 h，戊二醛固定后，扫描电子显微镜（Hitachi TM-1000，KYKY-EM3200）观察细菌形态特征[16]。 1.3 16S rDNA克隆和测序分析

采用CTAB 法提取菌株CF05的基因组DNA[17]。通用引物（8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1513R: 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增细菌的16S rDNA 序列[18]。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳纯化，进行测序。利用DNAMAN 和MEGA 5.1软件构建系统进化树。 1.4 生理生化反应

生理生化特征鉴定参照文献[19]和[20]方法进行。 1.5 平板测定拮抗病原真菌、病原细菌效果

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）平板中接入直径约6 mm的新鲜病原真菌菌丝饼，距菌丝饼约2.5 cm处接种待测菌株，以枯草芽孢杆菌B. subtilis 168菌株为对照，25 ℃培养，测量拮抗圈直径。每个处理3个重复。

采用Stonier[21]双层法测定其拮抗病原细菌效果。菌株CF05作为下层产素层，上层为病原细菌，以B. subtilis 168为对照。每个处理3个重复。 1.6 菌株CF05对番茄幼苗促生作用测定

菌株CF05发酵液和菌悬液的制备：挑取菌株CF05单菌落接种于PDB（PDA中不加琼脂）培养基中，28 ℃、160 r/min培养24 h，取100 μL培养液转接于100 mL的PDB培养基中，28 ℃、160 r/min培养80 h。所得培养液10000 r/min离心10 min。离心所得上清液用细菌过滤器（Millipore，0.22 μm）过滤后即为发酵液；离心所得菌体用无菌水清洗5次，然后再用无菌水重悬并调浓度至 107 CFU/mL，即为菌株CF05菌悬液[22]。

番茄种子（浙粉202，浙江浙农种业有限公司）用75%乙醇表面消毒30 s，无菌水漂洗3次。30 ℃温

第4期 郭芳芳等：一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定 491

水浸种4～5 h，种子于28 ℃催芽。种子发芽后，播种于穴盘（32孔，6 cm×4.5 cm）中，每穴2～3粒种子，覆盖1 cm厚基质（蛭石:珍珠岩:泥炭:土壤体积比为1:1:1:1）。待幼苗长出2片以上叶子后，开始浇灌发酵液和菌悬液，每次每穴浇灌10 mL。发酵液处理分为4个浓度梯度，将原发酵液分别稀释1、10、20、50倍，对照为无菌水；菌悬液处理分为3个浓度梯度，分别为107、106和105 CFU/mL，对照为无菌水。每个浓度5个重复，生长3周后测量幼苗鲜重及干重。 1.7 菌株CF05番茄根际定殖能力测定

平板筛选菌株CF05抗利福平的突变体，获得能在含20 µg/mL的利福平培养基上生长的抗性突变体。制备抗性菌株CF05菌悬液（方法同原始菌株CF05），菌悬液浓度分别为108、107、106和105 CFU/mL。经表面消毒的番茄种子浸入抗性菌株CF05不同浓度的菌悬液中，25 ℃、80 r/min振荡培养2～3 h后[23]，将种子置于28 ℃催芽，期间喷洒相应处理浓度的抗性菌株CF05菌悬液保持种子湿润。2～3 d种子发芽，将其种入穴盘（培养基质配方同1.6并经灭菌处理）中。待番茄出苗后2、7、12、17、22、27 d取土样（整个根系以及紧密黏着的土壤），每个处理3个重复。将1 g土样浸泡在9 mL的磷酸缓冲液（50 mmol/L）中，置于转速为150 r/min摇床振荡30 min。梯度稀释所得含菌缓冲液，涂布于含20 µg/mL利福平的LB培养基上，每个梯度3个重复。平板于28 ℃静置培养2 d后进行菌落计数。根际定殖细菌量以 log CFU/g 根计数[24]。 1.8 菌株CF05促进种子萌发效果测定及温室条件防治番茄猝倒病效果测定

制备浓度为108 CFU/mL 的菌株CF05、168菌液，多菌灵4000倍液（四川国光农化股份有限公司，50%可湿性粉剂）。灭菌培养皿中分别放入10 mL的菌株CF05、168菌液及多菌灵溶液，以无菌水为对照，每个处理3个重复。每皿放入1 g经表面消毒的番茄种子，处理12 h[25]。种子置于28 ℃催芽，计算萌发率。

PDB培养基培养番茄猝倒病病原菌P. aphanidermatum，制备菌丝悬浮液。菌丝悬浮液与无菌基质按照1:10（V/W）均匀混合，制成感病基质，分装入营养钵（26 cm×21 cm）中[26]。将上述所得萌芽种子种入营养钵中，每处理3个重复，每个重复25粒萌芽种子，播种25 d后计算发病率。 1.9 数据统计与分析

试验数据利用DPS v7.05数据系统进行统计分析，显著性水平采用Duncan’s新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 菌株CF05的鉴定

菌株CF05在NA培养基上形成乳白色菌落，半透明，菌落光滑，挑起有黏性。扫描电镜显示，菌体为棒状，单个，0.7 µm×4.2 µm（图1A），产生近球形芽孢（图1B）。

PCR扩增获得菌株CF05 16S rDNA部分序列（JX997944）。DNAMAN和MEGA 5.1软件系统发育分析结果显示，该菌株的遗传进化与多粘类芽孢杆菌最近，构成一个分支（图2）。生理生化反应特征（表1）显示，菌株CF05的耐盐性为2%，在5%含盐培养基上不能生长。在糖发酵反应中，可以利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、甘露醇、甘油、乳糖、蔗糖等多种碳源。厌氧生长、接触酶、硝酸还原反应、

图1 菌株CF05（A）及其芽孢（B）的扫描电镜细胞形态

Fig. 1 The morphological characteristics of strain CF05 (A) and its endospore (B) under scanning electron microscope

492 中 国 生 物 防 治 学 报 第30卷

图2 基于16S rDNA序列构建的菌株CF05的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain CF05 based on 16S rDNA sequences

表1 生理生化鉴定结果

Table 1 The results of physiological and biochemical characteristics

生理生化特征

Physiological and biochemical characteristic

耐盐性 Growth with NaCl 1% 2% 5% 10%

糖发酵Carbon source utilization D-葡萄糖D-Glucose L-阿拉伯糖L-Arabinose D-木糖D-Xylose 甘露醇Mannitol 甘油Glycerol 乳糖Lactose 蔗糖Sucrose

柠檬酸钠利用Sodium citrate utilization 琥珀酸钠利用Sodium succinate utilization H2S产生H2S production 厌氧生长Anaerobic growth 接触酶Catalase 氧化酶Oxidase

硝酸还原反应Nitrate reduction 水解酪蛋白Casein hydrolysis 水解淀粉Starch hydrolysis V-P反应V-P reaction

多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa CF05

＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋

枯草芽孢杆菌 B. subtilis 168

＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa ATCC 842T

＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋

水解淀粉、V-P反应、水解酪蛋白反应等均为阳性，而柠檬酸钠利用、琥珀酸钠利用、H2S产生、氧化酶等反应为阴性。菌株CF05与B. subtilis 168在耐盐性、氧化酶等方面的反应特点有所不同，与文献[27]报道的标准菌株P. polymyxa ATCC 842T的反应特点相同。结合16S rDNA序列分析和生理生化特征，将菌株CF05鉴定为多粘类芽孢杆菌P. polymyxa。 2.2 拮抗效果

菌株CF05对供试病原真菌、细菌均具有较好拮抗效果。其中在真菌拮抗中，对番茄灰霉菌拮抗效果最好，拮抗圈直径达到3.13 cm，其次是水稻稻瘟病菌，番茄早疫病菌，棉花枯萎病菌，水稻纹枯病菌，小麦纹枯病菌，所有拮抗真菌效果均优于B. subtilis 168。在细菌拮抗中，菌株CF05对水稻白叶枯菌拮抗作用最

第4期 郭芳芳等：一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定 493

明显，拮抗圈直径为4.51 cm，其次是白菜软腐病菌，拮抗病原细菌效果也均优于B. subtilis 168（表2）。 2.3 温室测定促生效果

温室条件下测定了菌株CF05不同浓度发酵液（图3A）和菌悬液（图3B）的促生效果。发酵液对番茄幼苗促生效果明显，鲜重和干重均有较大增量。发酵液稀释倍数为1、10、20、50倍时，与对照相比鲜重分别提高为272.0%、199.3%、142.7%、70.6%；干重分别提高为266.7%、127.8%、88.9%、33.3%。菌悬液同样具有促生作用，细菌浓度为107、106、105 CFU/mL时，与对照相比鲜重分别提高为121.7%、83.9%、13.3%；与对照相比干重分别提高为122.2%、66.7%、27.8%。发酵液的促生效果优于菌悬液。

表2 多粘类芽孢杆菌CF05拮抗病原菌效果 Table 2 Effect of P. polymyxa CF05 against pathogens

病原菌 Pathogen

水稻稻瘟病菌 M. oryzae 水稻纹枯病菌 R. solani 小麦纹枯病菌 R. cerealis 番茄灰霉菌 B. cinerea 番茄早疫病菌 A. solani

拮抗圈直径Diameter of antagonistic zone (cm)

多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa CF05

2.54±0.13 b 2.17±0.11 bcd 2.15±0.09 cd 3.13±0.06 a 2.23±0.14 bc

枯草芽孢杆菌 B. subtilis 168

2.15±0.17 ab 1.96±0.12 bc 2.00±0.12 b 2.33±0.23 a 2.13±0.14 ab 1.49±0.10 d 1.40±0.22 d 0.97±0.12 e 1.68±0.22 cd 3.30±0.57 a 3.74±0.46 a 3.46±0.19 a

棉花枯萎病菌 F. oxysporum f. sp. vasinfectum 2.20±0.22 bc 瓜果腐霉菌 P. aphanidermatum 1.62±0.09 e 西瓜枯萎病菌 F. oxysporum f. sp. niveum 0.97±0.22 f 百合根腐病菌 F. oxysporum f. sp. lilii 1.82±0.45 de 水稻白叶枯菌 X. campestris pv. oryzae 4.51±0.29 a 白菜软腐病菌 D. dadantii 葡萄根癌菌 A. vitis

3.85±0.16 b 3.72±0.07 b

注：表中数据为平均值±标准误，同列数据后小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），下同。

Notes: Data in the table were means±

SE. Different lowercase letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level. The same below.

质量 Weight (g

)

质量 Weight (g)

图3 不同稀释倍数发酵液（A）和不同浓度菌悬液（B）的促生效果

Fig. 3 Promotion of tomato growth after drenching with cell-free fermentation dilutions (A) and bacterial suspention at different

concentrations (B)

注：图中同一数据系列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

Notes: Different lowercase letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level. The same below.

2.4 菌株CF05番茄根际定殖能力

浓度为108、107、106、105 CFU/mL的菌悬液处理，出苗2 d后番茄根际细菌浓度分别为5.5、5.1、4.2、3.8 log CFU/g根，4个处理之间根际细菌浓度差异显著；7 d后浓度为108、107 CFU/mL菌悬液处理的菌量增加，浓度为106、105 CFU/mL菌悬液处理的菌量减少，浓度分别为5.8、5.5、4.2、3.6 log CFU/g根；此后，根际菌量持续下降，22 d后趋于稳定，27 d后终浓度为3.8、3.6、3.1、3.1 log CFU/g根（图4）。

494 中 国 生 物 防 治 学 报

番茄根际细菌浓度Bacterial concentration of tomato roots (log CFU/g)

第30卷

2712172227

时间 Time (d)

图4 菌株CF05在番茄根际定殖浓度变化

Fig. 4 The colonization of P. polymyxa CF05 in the rhizosphere of tomato.

2.5 菌株CF05促进种子萌发及防治番茄猝倒病效果

菌株CF05处理番茄种子发芽率为87.25%，B. subtilis 168处理为81.46%，2个处理与对照差异不显著（P＞0.05），多菌灵处理后种子萌发率为74.45%，与对照差异显著（P＜0.05）。菌株CF05处理后种子萌发率最高，与对照组相比效果提高11.7%，与B. subtilis 168处理相比提高7.6%，与多菌灵处理相比显著提高17.2%，说明菌株CF05对种子萌发具有促进作用。

菌株CF05处理番茄猝倒病发病率为17.28%，B. subtilis 168处理为21.78%，多菌灵处理为13.85%，对照为38.16%，3个处理与对照相比，发病率均差异显著（P＜0.05）。其中菌株CF05处理防效比对照防效高38.6%，比B. subtilis 168处理防效高20.7%，略低于多菌灵处理，但差异不显著（P＞0.05）。

表3 种子发芽率和番茄猝倒病防治效果

Table 3 Seed germination rate and control efficacy against tomato damping-off disease

处理Treatments

发芽率Seed germination rate (%)

发病率Disease incidence (%)

13.85±4.86 b 17.28±8.47 b 21.78±6.15 b 38.16±3.58 a

多菌灵Carbendazim 74.45±2.47 b 多粘类芽孢杆菌 P. polymyxa CF05 87.25±6.78 a 枯草芽孢杆菌B. subtilis 168

81.46±5.45 ab

对照Control 78.14±8.94 ab

3 讨论

本研究经形态特征、16S rDNA序列、生理生化反应特性分析，鉴定1株从柳杉上分离获得对多种病原真菌、病原细菌具有拮抗效果的菌株CF05，鉴定为多粘类芽孢杆菌P. polymyxa。该菌株对番茄幼苗具有显著的促生效果，能提高种子萌发率，稳定定殖于番茄根际，对番茄猝倒病具有明显的防治效果，表现出良好的应用开发潜力。

多粘类芽孢杆菌对植物病原真菌的拮抗作用已有大量报道，其作用主要表现在产生真菌细胞壁水解酶等拮抗物质[28]。Dijksterhuis等[29]报道P. polymyxa细胞直接作用于棉花枯萎病菌，说明持续抑制真菌生长要有活菌的存在。P. polymyxa CF05对鞭毛菌门、子囊菌门等真菌都表现拮抗效果，其作用机制可能与细菌产生的真菌细胞壁水解酶相关。多粘类芽孢杆菌能产生多粘菌素[7] 、嗜铁素[30]等细菌拮抗物质。与本文报道的P. polymyxa CF05对多种植物病原细菌表现明显拮抗效果一致。

P. polymyxa CF05在温室条件下对番茄幼苗具有较好的促生作用，生物量明显增加，而且P. polymyxa CF05的发酵液比菌悬液促生效果显著。其原因可能是通过固氮、溶磷作用产生营养物质或产生激素直接促进植物生长，或者通过抑制植物病原菌间接促进植物生长。P. polymyxa中发现了植物生长素合成通路的

第4期 郭芳芳等：一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定 495

相关基因以及吲哚-3-丙酮酸脱羧化酶（IPDC）[12]，说明该细菌可以产生植物生长素（IAA）。同时，固氮基因nifH也在多粘类芽孢杆菌中得到克隆[13]，说明该细菌具有生物固氮的特性。

P. polymyxa在多种植物上报道可以防治真菌、细菌以及线虫引起的植物病害。P. polymyxa处理植物后，可在植物根际大量定殖，并有效防治棕榈疫霉病和瓜果腐霉病的发生[1]。P. polymyxa GBR-1处理后的番茄根结数量明显降低[2]。P. polymyxa HKA-15的代谢产物可以有效防治柑橘溃疡病[3]。芝麻种子经P. polymyxa E681包衣处理后，可以显著控制猝倒病，解决了芝麻连作的难题[4]。本研究中也发现，P. polymyxa CF05处理后，番茄猝倒病发病率也明显降低，表现出良好的生物防治效果。其作用机制可能是P. polymyxa 产生拮抗类物质、诱导植物抗性等。P. polymyxa CF05可以稳定定殖于番茄根部，有利于占据根际生态位，也可能是该细菌发挥生防功能的重要方面。

参 考 文 献

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一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定

作者：作者单位：

郭芳芳， 谢镇， 卢鹏， 郭岩彬， 张立钦， 王勇军， GUO Fangfang， XIE Zhen， LU Peng， GUOYanbin， ZHANG Liqin， WANG Yongjun

郭芳芳,王勇军,GUO Fangfang,WANG Yongjun(浙江农林大学林业与生物技术学院，临安311300; 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，临安311300)， 谢镇,XIE Zhen(浙江省桐庐县林业局,桐庐,311500)， 卢鹏,LU Peng(浙江农林大学林业与生物技术学院,临安,311300)， 郭岩彬,GUO Yanbin(中国农业大学资源与环境学院,北京,100193)， 张立钦,ZHANG Liqin(生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室,临安,311300)

中国生物防治学报

Chinese Journal of Biological Control2014(4)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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