DGGE变性梯度凝胶电泳

DGGE 操作说明

DGGE 的应用：

主要应用于微生物多样性的检测和种群演替的分析。

DGGE 操作步骤

1. 将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。

2. 共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15.5cm ，短的那根长9cm 。将短的那根与Y 形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml 的注射器上。

3. 在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置!

4. 反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋纽。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置，旋紧体积调整旋纽。例如16*16cm gels(1mm thick)：设体积调整装置到14.5。

5. 配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中。

6. 每管加入18 μl TEMED，80 μl 10%APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上。

7. 通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够。

8. 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同Y 形管相连。

9. 轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，在这个步骤中最关键的是要保持恒定匀速且缓慢地

10. 小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。并把电泳控制装置打开，预热电泳缓冲液到60℃。

11. 迅速清洗用完的设备。

12. 聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。

13. 用注射针点样。

14. 电泳（200V ，5h ）。

15. 电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻璃板脱离。

16. 倒掉去离子水，加入 250 ml 固定液（10% 乙醇, 0.5% 冰醋酸）中，放置 15min。

17. 倒掉固定液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入 250 ml 银染液（0.2% AgNO3, 用之前加入 200μl 甲醛）中，放置在摇床上摇荡，染色 15min。

18. 倒掉银染液，用去离子水冲洗两次，倒掉后加入 250 ml 显色液（1.5% NaOH, 0.5% 甲醛）显色。

19. 待条带出现后拍照。

1. PCR扩增

与普通PCR 不同之处是Primer 上要加一个GC 夹（GC Clamp)，GC 夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC

常用的细菌16S 通用引物341fGC/518r的序列如下：

341fGC:

5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′ 518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′

2. 制作凝胶

需要的准备的试剂：

(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS ） 0.1g in 1ml H2O

(2)四甲基乙二胺(TEMED)

(3)0%和100%变性剂（100%的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见最下面的表格

准备四种不同浓度的凝胶：

顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS 溶液

底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS 溶液

如果DGGE 需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml ：

40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS 溶液

60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS 溶液

如需其它梯度，请重新计算。

这几种溶液加在一起后，很快就会凝固，所以混合之前一定要准备好凝胶制作装置。具体制作方法请参考凝胶制作装置的说明书。我们实验室用的是Hofer Gradient Maker，感觉效果还可以。

3. 电泳

将PCR 产物和Loading buffer 混合后加入胶孔，温度设定为60度，然后开始电泳。不同样品需要的电泳的电压和时间可能不同，需要优化一下，根据我的经验，120V, 6h对很多样品都比较和合适。

4. 染色

用万分之一的EB 或SYBR Green I 染色, 我比较了一下发现EB 效果明显优于SYBR Green I 。染色时间5分钟～30分钟都可以，染色时间太长效果并不一定好，我通常染5分钟。

5. 拍照

染色后小心地将凝胶转移到gel documentation system中拍照，要尽快操作，否则在紫外光的作用下，很快图像的效果就会降低。

6. 结果分析

如果需要对DGGE 结果进行定量分析，请参考：用Quantity One 进行定量分析的方法

需要说明的是，这种定量方法并不是很准，而且因为进行了PCR ，定量有很多问题。

下面PCR-DGGE 实验过程中用到的一些溶液的配置方法：

注意事项：

1 水温一定要达到60度才可以进行跑胶，加热棒不能在没水的情况下烧。 2 每块玻璃板之间一定要夹紧，否则漏水实验将无法进行。

3 TAE缓冲液最好是用新的。