叶绿素等含量测定

2.5.1 取样方法

分别于处理组和对照组的盆中进行取样。每次取生长发育一致的叶片5片左右，先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，用吸水纸擦干。把处理和对照的子叶包装好，立即放入液氮中速冻20min，然后置于﹣20℃低温冰柜中冷冻待测。 2.5.2 酶液的提取

用电子天平称取各处理的叶片

在冰块上研磨成匀浆(防止研磨0.5

过程中温度过高，酶失活)，配平后以4℃冰箱中待用。 0.4采用考马斯亮蓝G-2500.22.5.3.1标准曲线的制备

0.1

50

100

0以系列的标准牛血清蛋白(0、0.08 mg/ml、0.10mg/ml)溶液各2ml，分别加

入染料试剂2ml，立即混匀，于分光光度计波长620nm处测定其光密度，以蒸馏水2ml-1加染料试剂2ml作为比色的空白对照。根据测定结果，绘制出光密度-蛋白质浓度标准曲线，并配以直线方程式。

图2-1 可溶性蛋白含量测定标准曲线2.5.3.2酶液蛋白含量的测定

取考马斯亮蓝G-250染料试剂5mL，加入0.1ml上述提取的酶液，以0.1ml生理盐水加上5ml染料试剂作为对照，混合均匀后在波长595nm处测定其光密度。 2.5.4 超氧化物歧化酶活性的测定

采用NBT法测定SOD酶活性。在黑暗条件下，向小烧杯中分别加入：62.5mmol/l pH7.8磷酸缓冲液4ml、30mmol/ldl-甲硫氨酸0.2ml、3µmol/LEDTA0.1ml、1.125mmol/l NBT0.2ml、60µmol/l核黄素0.2mL，上述提取出的各处理的酶液0.05mL，以不加NBT和酶液但用缓冲液代替的混合液作为校零对照，测最大值时只不加入酶液但用缓冲液补齐，加完所有的物质后，在人工培养箱中用日光灯光照25分钟后，用分光光度计在波长560nm的情况下测定各管的OD值。以能抑制反应50％的酶量为一个SOD单位，其活力可由下面的公式计算：

SOD活力(U/mg蛋白)= (对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度/

[(50％)×加入粗酶液中的蛋白质含量(mg)]

1 叶绿素含量测定：

80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36） 也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰 Ca=13.95D665-6.88D649 Cb=24.96D649-7.32D665

Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245

蛋白含量/ug·ml

OD值

2.5.3 可溶性蛋白含量的测定

0.3

2超氧化物歧化酶（SOD）的测定： NBT(400ml)混合反应液:

392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液 （100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。 （另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na

测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。 04级方法

(1) 0.06 mmol/l核黄素溶液：称取0.2256克核黄素，使其溶解于蒸馏水中并定容至10ml.由于此药品见光即分解，故需要现用现配。

(2) 0.003mmol/l的EDTA溶液：称取EDTA0.0175克，使其溶解于蒸馏水中并定容至10ml。将溶液放入冰箱中保存待用。

(3) 1.125 mmol/l的NBT：称取0.1克NBT使其溶解于蒸馏水中定容至100ml，将溶液置于棕色瓶中4℃保存。 (4) 62.5 mmol/l pH7.8的磷酸缓冲液。

(5) 30 mmol/ldl-甲硫氨酸(蛋氨酸)：称取0.0895克蛋氨酸，使其溶解于蒸馏水中定容至20ml将溶液放入冰箱中保存待用。 （一）氮蓝四唑法 1. 方法提要

在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生 将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭 ，SOD通过催化

歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。 2. 仪器

荧光灯管。 离心机。 分光光度计。 pH计。 3. 试剂

（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。 （2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。 4. 测定步骤

（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。 （2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25~30μL酶液。在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。停止光照。在560nm波长下比色测 3过氧化物酶（POD）的测定：

0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。 0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。

04级 采用愈创木酚法测定POD酶活性。取光径1cm的比色杯2只，一只中加入反应混合液3mL，62.5mmol/l磷酸缓冲液1ml作为较零对照，另一只中加入反应混合液3mL，62.5mmol/l磷酸缓冲液0.9ml，上述提取得酶液0.1ml，立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测定OD值，每隔一分钟读数一次，以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以△OD470/min·mg蛋白质(或鲜重g)表示。

4.可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的《植物生理学实验指导》） 牛血清白蛋白：配成100µg/ml和1000µg/ml。 90％乙醇：90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。？？？ 85％（W/V）磷酸：170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。

考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90％乙醇中，加入85％（W/V）磷酸200ml，用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。 标准曲线的制作：

0.1ml 酶液（做三个重复） + 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀，放置2min后在595nm下比色。 5.丙二醛含量的测定

(1) 10%三氯乙酸：取10ml三氯乙酸加入90ml蒸馏水，混匀，放入冰箱待用。

(2) 0.6%硫代巴比妥酸：用天平准确称取0.6g硫代巴比妥酸于干净的100ml小烧杯中加入约30ml的50％乙酸溶液，溶解后将该溶液移入100ml容量瓶，用50％的乙酸溶液定容，摇匀。 1 样品制备

称叶片1g研钵中，加入少量石英砂和10%三氯乙酸5mL研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用10%三氯乙酸8ml分两次冲洗研钵，合并提取液。 .2 显色反应

在提取液中加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，摇匀，将试管放入沸水浴中煮沸10分钟，（自试管内溶液中出现小气泡时开始计时），到时间立即取出试管并冷却。 3 比色测定

待试管内溶液冷却后，在4000r/min离心10分钟，取上清液并量其体积。以2ml水为对照测定450nm、532nm和600nm处的吸光值。 4 结果计算

每克样品中丙二醛含量：

C (μmol/l)=(6.45OD532－OD600)－0.56OD450 (C —提取液中丙二醛浓度)