实验报告-硝酸还原酶活性的测定
首都师范大学生命科学学院实验报告
课程名称 植物生理实验 实验时间 2010.3.31 成绩 姓名 唐倪文 班级 3 学号 1090800032 实验题目 硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO3-使之还原为NO2-。
- ++ -+
NO3+ NADH + H→ NO2 + NAD + H2O
产生的NO2-可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反应液中NO2-含量的增加即表明酶活性的大小。 NO2-含量的测定----磺胺法
- NO2与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。
二、实验用品
1.材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗
2.仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头（两种规格：1000μl，200μl）
三、实验步骤
1.分别配制反应液于小烧杯中
(1)0.1M磷酸缓冲液5ml + 蒸馏水5ml (2)0.1M磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNO3 5ml
2. NO2-的获得
(1)称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。
(2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其中的空气,内部产生的NO2-可渗透到外部溶液中。
3.将小烧杯转到30℃温箱,使其不见光,保温20min。
4.用5μg/ml NaNO2母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 0.5 、0.1、0 μg/ml。
5.吸取不同浓度的NaNO21ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60℃水浴中保温20min，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。
5. 吸取反应液各1 ml于试管中加入磺胺和-萘胺各2 ml,60℃水浴20min,生成粉红色化合物.用比色法在520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得NO2-的含量，
6.计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO2-微克数表示（ NO2- /h.g）。
完全培养液，KNO3
酶活性=[(1.791/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 105.39 完全培养液，H20
酶活性=[(1.771/1)*10]/[0.51*(20/60)]= 104.18 缺N培养液，KNO3
酶活性=[(0.654/1)*10]/[0.49*(20/60)]= 40.04 缺N培养液，H2O
酶活性=[(0.392/1)*10]/[0.48*(20/60)]= 24.50 将结果填入上表。
四、实验结果分析
①在完全培养液和缺N培养液中，加KNO3普遍都要比加H20的酶活性高，说明KNO3为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。
②在完全培养液和缺N培养液中，加KNO3相互比较，加H20的相互比较，完全培养液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。
五、思考题
1.依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影响NO2-的浸出量？
答：①实质是以亚硝酸根（NO2-）的含量来表示的。因为NO2-可以从组织内渗到外界溶液中并积累，因此测定反应溶液中NO2-的含量的增加，即表明酶活性的大小。
②真空泵抽气影响NO2-的浸出量。因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。
2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H20和一组培养液中加入KNO3的作用是？ 答：①培养时做完全培养和缺N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。
②实验时一组加KNO3一组加H20是因为KNO3为酶促反应提供底物，让反应得以彻底进行。
3.实验前要使材料经一定时间光照，其作用是？ 答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物。
4.小烧杯置于30℃，不见光保温的原因是？
答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸镁把NO2-还原成NH3。暗反应下反应可阻止NO2-的继续反应。
5.第一次30min和第二次20min的作用是？ 答①阻止NO2-的继续反应
②让NO2-和磺胺，α-萘胺反应充分，显色完全。显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。