黄柏总生物碱提取方法及工艺研究
第16卷第2期2010年2月中国实验方剂学杂志
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulaeVol.16,No.2Feb.,2010
黄柏总生物碱提取方法及工艺研究
刘丽梅,王瑞海,陈 琳,陈韩英,杨立新,刘凤华
1
1
1
2
3
43
,许剑琴
5
(1.中国中医科学院中医基础理论研究所,北京 100700;2.石河子大学药学院,新疆石河子 832000;
3.中国中医科学院中药所,北京 100700;4.北京农学院,北京 102206;
5.中国农业大学动物医学院,北京 102206)
[摘要] 目的:筛选二类中兽药畜禽抗应激颗粒中黄柏总生物碱提取工艺。方法:采用L9(34)正交设计法对黄柏药材提取时所用乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数进行考察;采用单因素考察法对黄柏药材提取粒度进行考察。结果:黄柏提取总生物碱最佳提取工艺为:黄柏细丝2～3mm,用药材10倍量75%乙醇回流提取3次,每次提取115h。结论:该工艺稳定,质量可控,可用于产业化生产。
[关键词] 黄柏;总生物碱;提取;正交设计
[中图分类号] R28316 [文献标识码] B [文章编号] 100529903(2010)02200032 畜禽抗应激颗粒由黄柏、苍术、藿香、石膏以不在兽医临床研究中,。黄柏为芸香科植物黄皮树chinenseSchneid.的干燥树皮。黄柏含有多种生物碱,主要为小檗碱,其它生物碱有巴马丁、药根碱、黄柏碱、蝙蝠葛任碱、白瓜蒌碱、木兰花碱等
[1]
[收稿日期] 2008205218
[基金项目] 北京市科技计划课2008BADB4B07)
[通讯作者] 3E2liulimeihrb
。资料表明黄柏总生物碱具有抗溃疡及抗腹泻
成分含量无显著影响(P>011),直观分析A3>A2>A1;因素B即乙醇浓度有一定影响(PB3>B1;因素C即提取时间无显著影响(P>011),
必要对中药提取过程中的沉降物进一步的研究。[参考文献]
[1] 国家中医药管理局编委会.中华本草[M].上海:上海
直观分析C1>C2>C3;最佳工艺条件为A3B2C1,即10倍量70%乙醇回流提取2次,每次015h。
科学技术出版社,1999:874.
[2] 蔡逸平,曹岚,范崔生.枳壳类药材化学成分研究简报
[J].江西中医药,1998,19(6):46.
[3] 刘振丽,宋志前,季燕燕,等.枳实饮片中有效成分含量
实验结果显示(表4),甜橙枳实乙醇提取液静置后产生的沉降物中含有大量的黄酮类成分,由表
5可以看出,沉降物中橙皮苷和柚皮芸香苷总量占饮片中两种成分总量的2011%,提取液占4016%,在提取后应该将它们合并。
很多中药提取液在冷藏放置时都会产生沉降物
[7]
测定.全国中药标准研究学术讨论会论文集.珠海,
2005.
[4] 王淳.不同品种产地枳实有效成分的对比分析[D].中
国中医科学院2009硕士博士论文.
[5] 王淳,刘振丽,宋志前,等.中药枳实提取工艺研究[J].
。对于含有在冷水中溶解度小的有效成分的中
药,在制剂工艺提取后,提取液静置出现的沉降物不
应轻易作为杂质弃去,应在研究后再确定具体方案。沉降物的产生除了因为温度变化的原因外,由于醇提液与蒸馏后的水溶液合并,造成了乙醇浓度变化,而不同化学成分在不同乙醇浓度中有差异,因此有
中国实验方剂学杂志,2008,14(9):23.
[6] 王青,袁丹.不同产地枳实与枳壳中黄酮类成分的含量
测定[J],黑龙江医药,2008,21(3):1.
[7] 任秀莲,魏琦峰,周春山,等.沉淀吸附法提取苦丁茶中
的熊果酸[J].中南大学学报(自然科学版),2004,35
(4):599.
・3・
第16卷第2期2010年2月中国实验方剂学杂志
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
[2]
Vol.16,No.2
Feb.,2010
作用,对免疫功能具有调节作用
,是本课题提取的
色法:精密量取上述溶液1mL,置50mL量瓶中,加0105mol・L硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,另取乙
-1
有效部位,课题以黄柏总生物碱提取率为考察指标,对资料报道的黄柏总生物碱4种提取方法:酸提法、碱提法、醇提法、酸醇提法1 仪器与试药
SPS202OHAUS电子天平(梅特勒2托利多(常
[324]
醇1mL,置50mL量瓶中,加0105mol・L硫酸溶液稀释至刻度,摇匀,作为空白对照溶液,检测波长:345nm。
213 黄柏总生物碱提取方法的考察 取黄柏药材
-1
进行试验对比,确定乙
醇提取法,并对乙醇提取方法的工艺参数进行优选。
粉碎成最粗粉,共4份,每份100g,按文献
[3～6]
工艺
州)称重设备系统有限公司),RR2182电磁炉(尚朋堂(广州)电器有限公司),ZDHW电热套(北京中星伟业仪器有限公司),RE25205旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器设备有限公司),Agilent1100高效液相色谱仪(美国)。
硫酸,生石灰,乙醇均为分析纯。
黄柏药材购自河北安国,经中国中医科学院中药研究所冯学峰副研究员鉴定为芸香科植物黄皮树
PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮,其盐酸
进行提取。采用紫外分光光度法测定提取物中总生物碱百分含量。提取物总生物碱含量、总生物碱收得率结果见表1。
表1 黄柏药材不同提取方法样品含量、
总生物碱收得率测定(%)
提取工艺酸水提取法碱水提取法乙醇提取法酸醇提取法
干膏收率
[**************]0
总生物碱含量
[1**********]168
总碱得率
[**************]3
小檗碱的含量为3165%。2 方法与结果
211 盐酸小檗碱含量测定方法
21111 色谱条件 仪器4,故本研究采用乙醇提取黄24黄柏总生物碱提取工艺的正交优选 根据对
相色谱仪;色谱柱(416mm,
5μm);流动相:1%(50∶50),每100mL011g;波长:265nm;流
黄柏提取可能有影响的因素:乙醇浓度、乙醇用量、
4
提取次数、提取时间4个因素,采用L9(3)正交表进行正交设计。取同一批黄柏药材粉碎成最粗粉,均匀称取9份,每份100g,按表2条件进行试验,提取、浓缩、干燥得提取物。采用紫外可见分光光度法测定提取物中黄柏总生物碱含量,计算总生物碱提取率。试验设计的因素水平表、正交试验表、方差分析表见表2～4。
表2 因素水平表
因素
水平A(乙醇浓度)B(乙醇用量)C(提取次数)
(%)
123
957555
(倍)6810
(h)123
D(提取时间)
(h)110115210
速:110mL・min;柱温:35℃。
21112 标准曲线的制备 取干燥至恒重的盐酸小
-1
檗酸对照品适量,精密称定,加乙醇制成每1mL含
0114mg的溶液。分别精密吸取2,4,6,8,10μL注入液相色谱仪,连续进样3次,测定峰面积,以对照品进样量为横坐标,对照品峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明,盐酸小檗碱在0128～1140μg范围内线性良好。其回归方程为Y=4157×10X-1157×10,r=019998。
21113 供试品溶液的制备 取上述样品约50mg,
5
6
精密称定,置100mL量瓶中,加乙醇80mL,超声处理30min,加乙醇至刻度,摇匀,过012μm滤膜,即得。
21114 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱115mg,置10mL量瓶中,加乙醇溶解并稀释至刻
由方差分析可以看出,提取次数C对黄柏总生物碱提取率有显著性影响,其它3个因素对黄柏总生物碱提取率没有显著性影响。根据直观分析,乙醇浓度选A2、乙醇用量选B3、提取时间选D2。由于提取次数对黄柏总生物碱提取率有显著性影响,在筛选出的其它参数不变的情况下,对提取次数继续进行考察,结果见表5。
度,摇匀,即得。
212 黄柏总生物碱含量测定方法
21211 仪器 T6新世纪紫外分光光度计,方法:比
・4・
第16卷第2期2010年2月中国实验方剂学杂志
ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae
表3 黄柏提取正交实验
Vol.16,No.2
Feb.,2010
总生物碱提取率几乎没有差别。从生产实际情况考
总碱提取率(%)
[***********][***********][**************]9
实验号
123456789
K1K2K3R
A[***********][***********]
B[***********][***********]
C[***********][***********]
D123312231
虑,细丝便于加工和提取,故黄柏药材宜制成细丝进行提取。黄柏提取的最佳工艺为黄柏细丝(2～3)mm,用生药10倍量75%乙醇回流提取3次,每次提取115h。216 黄柏药材提取工艺的验证实验 取同一批黄柏药材,称取3份各100g,按优选的最佳工艺进行提取,样品减压干燥。采用高效液相色谱法测定样品中盐酸小檗碱含量,采用紫外分光光度法测定总生物碱百分含量,计算出膏率、盐酸小檗碱转移率、总生物碱提取率。实验结果见表7。
表7 黄柏药材提取工艺的验证实验(%)
样品出膏率
盐酸小檗碱盐酸小檗碱总生物碱含量
[1**********]0
[***********]00
1313200CT=20014112
总生物碱提取率
[**************]0
表4 黄柏提取总生物碱方差分析表
变异来源
BCD
转移率
98126195
含量
[***********]24
离差平方和自由度
[***********]010484
2222
均方
[***********]010242
F值P值12
[***********][1**********]36
3
误差
F0101(2,2)=9910,F0105(2,2)=1910
表5 黄柏提取次数考察(%)
提取次数(次)
34
出膏率
3014114183
31944150
,出膏率
30110%,盐酸小檗碱转移率平均为98195%,总生物碱含量平均为15124%,总生物碱提取率平均为4160%。3 讨论在文献报道的黄柏总生物碱4种提取方法中,传统工业生产中常用酸水提取法提取小檗碱。本研究结果表明该方法虽然提取收率高,但总生物碱的含量较低。本研究采用乙醇提取法提取物总生物碱含量、提取率均很高,但相比之下成本要更高些,采用该方法的主要原因是便于下一步纯化达到二类中兽药有效部位含量大于提取物的50%的要求。[参考文献]
[1] 王本祥.现代中药药理与临床[M].天津:天津科学技
[2～3]
实验结果表明,黄柏提取3次、4次样品中总生
物碱百分含量没有差别,总生物碱提取率相差不大,从生产周期和成本角度考虑,黄柏提取次数定为3次。215 黄柏总生物碱提取粉碎粒度的考察 取同一批黄柏分别炮制成最粗粉(10目)、细丝(2～3mm)、块(10～20mm),每份各100g,按上述优选的工艺参数A2B3C3D2提取,以干膏总生物碱提取率为考察指标,优选黄柏总生物碱提取的最佳粉碎粒度。实验条件及结果见表6。
表6 黄柏总生物碱提取粉碎粒度的考察条件及结果(%)样品
123
术出版社,2004:1385.
[2] 高红旺,张文希,田济民,等.不同工艺对黄柏中黄连素
粉碎粒度最粗粉细丝(2～3mm)块(10～20mm)
出膏率
[**************]
总生物碱含量
[**************]
总生物碱提取率
[1**********]0
提取量的影响[J].第四军医大学吉林医学院学报,
2003,25(1):29.
[3] 郭书好,李素梅,张复兴,等.酸醇法从黄柏中提取黄连
素[J].暨南大学学报(自然科学版),1994,15(1):
130.
[4] 尹蓉莉,杨军宣,李 化.黄柏中盐酸小檗碱提取实验
实验结果表明,黄柏药材粉炮制成最粗粉和细丝,其总生物碱提取率优于炮制成块,而且此时二者
方法的改进[J].基层中医药杂志,2000,14(6):27.
・5・