细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展
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・２０７・
・综述・
细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展
吴清胜李侠综述
【摘要】
肖詹蓉张萍审校
细菌荚膜多糖具有良好的免疫原性，是诱导有效免疫应答的主要抗原物质，可以用来制
备多糖疫苗和多糖．蛋白结合疫苗。此文对细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展作一综述。
【关键词】多糖类，荚膜；疫苗；纯化；检测
Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｂａｃｔｅｒｉａｌｃａｐｓｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
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某些细菌，如脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、肺炎根据荚膜的特征可将其分为大荚膜、微荚膜和黏液层。大荚膜与细胞壁结合十分牢固，厚度大于０．２¨ｍ，如肺炎链球菌的荚膜；微荚膜与细胞壁结
合牢固，厚度小于０．２ｔｘｍ，如伤寒沙门菌Ｖｉ抗原；
链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌等，表面被覆一层荚膜，荚膜的主要成分是多糖，是细菌的保护性抗原和毒力因子…。细菌荚膜多糖作为制备疫苗的候选抗原，在纯化过程中需去除菌体蛋白、核酸、内毒素等杂质，以减少疫苗引起的不良反应。目前，国内的细菌荚膜多糖纯化工艺一直沿用传统的酚抽提方法，该法需多次超速离心，长时间透析，并大量使用乙醇、苯酚等有毒有害试剂，会对操作者的健康以及环境造成严重的危害拉ｏ，因此新纯化工艺的开发迫在眉睫。有效的荚膜多糖检测方法在多糖疫苗或多糖一蛋白结合疫苗质量控制中的应用可充分保证疫苗的质量。本文对荚膜多糖纯化工艺和检测方法的发展进行概述。
１１．１
黏液层疏松黏附于细菌表面，边界不明显且易脱落。多数细菌的荚膜主要成分是多糖，如流感嗜血杆菌的荚膜；少数细菌的荚膜成分为多肽，例如炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌的荚膜；有些细菌的荚膜还包含脂类或脂类蛋白复合体。
１．２
化学性质
大多数细菌的荚膜多糖是由２种以上的单糖（如Ｄ一葡萄糖醛酸、Ｄ．半乳糖、￡一鼠李糖等）及其他化学基团组成的基本单元，经过重复聚合而形成的线性大分子物质。荚膜多糖大部分是酸性黏多糖，属杂多糖类，如Ａ群脑膜炎球菌荚膜多糖是Ⅳ．乙酰一３－０一乙酰甘露糖胺磷酸盐的线性共聚物旧Ｊ，ｂ型流感嗜血杆菌（Ｈｉｂ）荚膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷
酸盐Ｈｏ。也有一些细菌的荚膜多糖是由乙酰化的同
细菌荚膜的特征
生物学特征
细菌荚膜是细菌细胞壁外的一层黏液性物质，
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４２１１．２０１３．０４．００９
基金项目：重大新药创制疫苗综合性技术研究开发大平台建设
质多糖组成，如伤寒沙门菌Ｖｉ抗原就是由Ｎ一０一乙酰．Ｏ．半乳氨基糖醛酸残基所组成”Ｊ。多糖分子的组成和构型多样，结构复杂，是细菌血清学分型的基础。根据血清学反应的差异，推测肺炎链球菌的荚膜多糖
至少有７７种不同的化学结构。迄今为止，绝大多数
（２０１３ＺＸ０９４０２３０２）
作者单位：１０００２４北京天坛生物制品股份有限公司细菌性疫苗研究室
通信作者：张萍，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｐｉｎｇｈａｏｙｕ＠１６３．ｔｏｍ
万方数据
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细菌的荚膜多糖化学结构已经得到确认，细菌荚膜多糖长链结构的非还原端是最远端，是多糖分子的抗原决定簇，并能诱导抗体产生；多糖长链结构的中间部分一般不能诱导抗体产生。细菌荚膜多糖主要以共价键的形式与菌体结合。
１．３
免疫原性
荚膜处于细菌的最外层，不仅可保护细菌免受杀菌和抑菌物质的侵害以及宿主吞噬细胞的吞噬，还可有助于细菌黏附于宿主细胞表面以引发感染。荚膜多糖是细菌变异最少的表面抗原之一，具有良好的免疫原性，能诱导特异性免疫应答，产生有效的保护性抗体。目前，以荚膜多糖作为靶抗原已经成功制备了多种疫苗，如肺炎链球菌多糖疫苗、伤寒Ｖｉ多糖疫苗、ＡＣＹＷｌ３５群脑膜炎球菌多糖结合疫苗和Ｈｉｂ多糖结合疫苗等，这些多糖疫苗或多糖一蛋白结合疫苗在疾病的预防和控制方面发挥了巨大的作用，大大降低了相关疾病的发病率。
影响荚膜多糖免疫原性的因素有很多，主要有多糖分子的大小、多糖结构的完整性以及特殊化学
基团的含量。研究表明，１个１４型肺炎链球菌荚膜多糖抗原表位的表达至少需要４个多糖重复单位，
而要形成２个有效的抗原表位，则需要２２个多糖重复单位，这说明多糖的相对分子质量不能太小，否则会影响其免疫原性¨Ｊ。一般只有相对分子质量
大于１０００００的多糖才对人体具有免疫原性。临床
研究表明，Ａ群脑膜炎球菌荚膜多糖在温度和水分含量较高的条件下容易降解，随着相对分子质量的
减小，其免疫原性也显著减弱。另外，多糖的特异
化学基团含量也是影响其免疫原性的重要因素。每种荚膜多糖都含１种以上的特异性化学基团，如核糖、糖醛酸、氨基己糖、甲基戊糖等。非糖苷取代基，如Ｏ一乙酰基、丙酮酰基、磷酸胆碱等与肺炎链球菌荚膜多糖的免疫原性密切相关。在碱性条件下，Ａ群脑膜炎球菌和伤寒沙门菌Ｖｉ荚膜多糖的Ｏ一乙酰基会发生移位或丢失，而发生变异的多糖就不能诱生保护性抗体。然而最近研究表明，用丢失Ｏ一乙酰基的９Ｖ和１８Ｃ型肺炎链球菌荚膜多糖免疫人体和动物后，仍能诱生具有调理吞噬功能的抗体；去除０一乙酰基的ｃ群脑膜炎球菌多糖一蛋白结合疫苗的临床试验效果并不低于完整保留０．乙酰基的多
糖一蛋白结合疫苗。
２
细菌荚膜多糖的纯化
提取的细菌荚膜多糖中混有菌体蛋白、核酸和
万方数据
内毒素等多种杂质，如用包含这些杂质的多糖疫苗免疫则会引起严重的不良反应。因此，只有经过提纯后的荚膜多糖才能用于疫苗制备。理想的荚膜多糖纯化工艺不仅要求在多糖纯化过程中可有效去除杂质并保持多糖的免疫原性，同时还应操作简
单，易于线性放大。
２．１
多糖纯化工艺的现状
传统的细菌荚膜多糖纯化工艺包括，荚膜多糖的沉淀、核酸的去除、多糖粗制品的制备、多糖的精制、内毒素的去除等步骤。现行的纯化工艺，不仅需要多次超速离心，还必须使用大量的乙醇和苯酚。超速离心，成本高；乙醇易燃，对厂房和设备的要求严格，工艺不易放大；苯酚是强腐蚀性物质，会对操作人员和环境造成严重危害。随着疫苗的质量标准和环保要求的不断提高，乙醇、苯酚等试剂将被限制使用。
２．１．１
荚膜多糖的沉淀目前广泛使用十六烷基
三甲基溴化胺（ＣＴＡＢ）来沉淀细菌荚膜多糖，具体过程为：将细菌培养物离心去除菌体，收集上清液并加入ＣＴＡＢ充分混匀，离心收集沉淀物。２．１．２核酸的去除在多糖纯化过程中，去除核酸的常用方法是有机溶剂（乙醇）沉淀法，具体操作包括：在离心收集的沉淀物中加入终浓度为１
ｍｏｌ／Ｌ
的氯化钙溶液，以使荚膜多糖与ＣＴＡＢ解聚，再加入最终体积分数为２５％的乙醇进行核酸沉淀，最后离心去除沉淀并收集上清液。
２．１．３
多糖粗制品的制备粗制多糖目前常用的
方法是有机溶剂（乙醇）沉淀法，具体操作包括：在收集的上清液中加入最终体积分数为８０％的乙醇并离心收集沉淀的多糖，分别用冷却的无水乙醇和丙酮清洗２次以上，将粗制的多糖沉淀物置于灭菌的滤纸上使丙酮挥发，待粗制的多糖颜色变成乳白色时，立即将沉淀物用灭菌的滤纸包好，充分干燥后，于一２０℃以下保存备用。
２．１．４
多糖的精制精制多糖所采用的方法主要
是苯酚抽提法和乙醇沉淀法，具体过程包括：将多糖粗制品溶解于１／１０饱和中性醋酸钠溶液中，冷酚提取２～３次后离心收集上清液，用０．１％氯化钙溶液或适宜溶液透析。在经过透析的上清液中加入乙醇至最终体积分数为８０％，离心收集沉淀物，分
别用无水乙醇和丙酮清洗２次以上，并用注射用水
溶解沉淀物，所得的溶液即为纯化的多糖原液。
２．１．５
内毒素的去除细菌内毒素是革兰阴性菌
国医生物剑昌堂盘查！！！！生！旦墓堑鲞筮堡翅！堕』垦ｉ！！！臣！坐：垒！理壁！！！！：ｙ！！：堑：塑！：兰
・２０９・
细胞壁的特有结构，主要成分是脂多糖，是细菌重要的毒力因子，可引起动物和人体发热及出现微循环障碍、休克和播散性血管内凝血等¨Ｊ。在多糖的纯化过程中常采用超速离心法来去除内毒素。
２．２
新型荚膜多糖纯化工艺的探索
苯酚是一种有毒试剂，对生产操作者和环境会
造成严重的危害，随着疫苗质量和环保要求的提高，传统酚抽提纯化工艺将被淘汰。对于荚膜多糖的纯化，中空纤维分离法、超滤法、酶解法、柱层析法和无机物沉淀法等具有纯化条件温和，容易线性放大等优点，为细菌荚膜多糖的纯化提供了新的选择，综合使用这些荚膜多糖的纯化方法，将有望探索出一套新型荚膜多糖纯化工艺。
２．２．１
中空纤维分离法中空纤维是由半透性的
空心细管组成的纤维束装置，具有分子筛作用，固液分离效果很好，完全可以替代离心机来有效去除
发酵液中的菌体和固体杂质。中空纤维是开放式
通道，可以处理固体含量高、组成复杂的混悬液。该法具有成本低，操作简单，易于线性放大的优点。
２．２。２
超滤法内毒素在水相环境中以高分子聚
合物的形式存在，相对分子质量接近荚膜多糖，难以去除。螯合剂乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）可以螯合脂多糖表面的带电离子，使带负电的脂多糖相互排斥而解离成单体；去污剂脱氧胆酸钠（ＤＯＣ）可以破坏脂多糖的疏水作用而使内毒素聚合体解聚。使用ＥＤＴＡ或ＤＯＣ处理提取的细菌荚膜多糖，可将多糖制品中的内毒素解聚成小分子单体，这些小分子单体可经特定孔径的超滤膜超滤而得到去除旧Ｊ。
２．２．３
酶解法提取的荚膜多糖中混有的核酸和
杂蛋白的相对分子质量很大，与多糖的相对分子质量接近，很难去除。利用核酸和蛋白质能被相应的酶水解成小分子的特性，通过酶解法能将核酸和杂
蛋白去除。Ｔａｋａｇｉ等归。在提纯Ｈｉｂ荚膜多糖时，采用含有２
ｍｍｏＬ／Ｌ
ＭｇＣｌ，和２０
ｍｍｏＬ／Ｌ
ＮａＣＩ的Ｔｒｉｓ－
ＨＣｌ作为缓冲液，以核酸内切酶降解核酸，链霉蛋白酶Ｅ和胰蛋白酶降解蛋白质，最终获得的Ｈｉｂ荚膜多糖的各项质量指标均符合相关规定。
２．２．４
柱层析法柱层析技术又称柱色谱技术，
是利用待分离物质在固定相与流动相之间的不同
分配比例，达到分离目的的技术。对生物大分子物质（如蛋白质、核酸和荚膜多糖等）的分离有极高的分辨率。Ｐａｔｏ等旧。使用柱层析法对ｃ群脑膜炎球菌多糖进行纯化：连续流离心去除菌体；切向流超
万方数据
滤（１００Ｋ）浓缩；离心，取上清液；上清液中加入
０．５％ＤＯＣ，５５
ｏＣ处理３ｍｉｎ后，１００Ｋ切向流超滤；离
子交换层析（Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ）和分子排阻层析（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｃＬ．４Ｂ）；收集样品，透析除盐后冻干。这项工艺的荚膜多糖回收率高达６７％，而且纯化的多糖的各项指标均符合相关规定的要求。该工艺采用的柱层析法能有效去除杂蛋白，而且在纯化步骤得到简化同时，避免了乙醇、苯酚等有毒试剂的使用。
２．２．５
无机物沉淀法鉴于有机试剂存在毒性，
人们尝试通过无机物沉淀法来提纯细菌荚膜多糖。Ｋｏｔｈａｒｉ等［１叫在纯化伤寒沙门菌Ｖｉ多糖的过程中，采用无机物（硫酸铵）沉淀法来纯化多糖，结果显示，硫酸铵能有效去除核酸，获得的伤寒沙门菌Ｖｉ多糖符合ＷＨＯ的相关要求。
３
细菌荚膜多糖的检测技术
对荚膜多糖的检测，是全面掌握荚膜多糖特性和
控制疫苗质量的关键。细菌荚膜多糖的检测包括：杂质含量检测、特异性基团的检测、抗原性检测、分子大小的检测和多糖核磁共振分析等。经过提纯的细菌荚膜多糖，可以制备成单价、多价多糖疫苗或多糖一蛋白结合疫苗。多价多糖疫苗和多糖一蛋白结合疫苗与单价多糖疫苗的检测要求有所不同。
３．１在单价多糖疫苗质量控制中的应用
３．１．１
比色法特殊化学基团与特定的试剂反
应，能够显现出特定的颜色，用分光光度计在特定
波长下进行比色，就可对荚膜多糖中的杂质或特殊化学基团的含量进行检测。该法在单价多糖疫苗质量控制中主要用于蛋白含量检测、磷含量检测、唾液酸含量检测、Ｏ．乙酰基含量检测和甲基戊糖含
量检测等。
３．１．２
双向免疫扩散试验当多糖抗原与相应抗
体在凝胶中相遇时可发生特异性反应而出现白色
的沉淀线，表明多糖具有良好的特异性或抗原性。该法常用于多糖的鉴别实验或抗原性检测。
３．１．３色谱法该法主要用于多糖分子大小的检测，常用的色谱法包括凝胶色谱法和高压液相色谱法。相对于凝胶色谱法检测多糖分子大小费时、样品用量大的特点，高压液相色谱检测既可有效分析
荚膜多糖的完整性和稳定性，又能准确定量多糖抗
原的含量，与耗时较长的凝胶色谱法相比，高压液相色谱检测多糖分子大小仅需７
ｍｉｎ。
３．１．４
核磁共振技术该法是解析物质结构最有
效的手段，近年来已逐步用于多糖结构研究和质量
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控制。核磁共振技术检测不仅可获得多糖的单糖组成、单糖残基间顺序、单糖残基在糖苷键中的位置、环状结构类型和糖苷键构型等信息，而且还可显示多糖中的微量杂质情况。ＭＥＲＣＫ公司已将核磁共振技术纳人多糖疫苗的质量检测规程中。
３．２
在多价多糖和多糖－蛋白结合疫苗质量控制中的应用
随着多价多糖疫苗和多糖一蛋白结合疫苗的问
世，对疫苗中各组分的定量检测就非常重要，常用的检测方法包括比色法、免疫学方法和高效阴离子交换色谱－脉冲安培电化学法等。
３．２．１比色法利用多糖中特殊化学基团所占一定的比例，通过检测该基团的含量来推算多糖的含量。该法因操作简单而得到广泛使用，如采用比色法检测Ａ群脑膜炎球菌多糖中的磷、Ｃ群脑膜炎球菌多糖中的唾液酸、Ｈｉｂ中的核糖来定量相关多糖
的含量。
３．２．２
免疫学方法当多价多糖疫苗中的各种多
糖不能通过比色法进行定量时，可通过免疫学方法进行检测，常用的检测方法包括火箭免疫电泳法、
速率散射比浊法。
３．２．２．１
火箭免疫电泳法该法是单向免疫扩散
和电泳相结合的定量检测方法。多糖在含抗体的
琼脂凝胶中电泳，在电场的作用下，泳动的多糖抗原与琼脂凝胶中的相应抗体形成抗原一抗体复合物沉淀峰，沉淀峰的高度与多糖抗原量呈正相关，通过检测峰高可定量多糖的含量。
３．２．２．２
速率散射比浊法当抗原与抗体比例合
适时，形成的可溶性免疫复合物可在促聚剂（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出形成微粒，使反应液出现浊度，经速率比浊仪检测浊度可定量多糖的含量¨１Ｉ。
３．２．３
高效阴离子交换色谱．脉冲安培电化学法
将待检多糖样品用酸溶液（氢氟酸或三氟乙酸）处理，使多糖分子水解为单糖，经过层析，不同单糖的出峰位置各不相同，根据各单糖的含量可推算多糖的含量。采用高效阴离子交换色谱－脉冲安培电化学法检测多价多糖疫苗和多糖一蛋白结合疫苗，不仅可准确地检测疫苗中多糖的含量，还可检测结合疫苗中微量游离多糖的含量¨２｜。该法具有操作简单、灵敏度高、检测结果准确的特点，是电化学法成功用于多糖检测的范例。
４
结语
目前，细菌荚膜多糖纯化主要采用传统的酚抽
万方数据
提工艺。随着疫苗质量和环保标准的不断提高，苯酚将被限制使用，酚抽提工艺将被新工艺替代。对中空纤维分离、超滤、柱层析等方法的探索研究，有望开发出一套纯化条件温和、工艺流程简单、易于工业化放大的新型纯化工艺。细菌荚膜多糖的质量控制是生产安全有效疫苗的关键。荚膜多糖检测的常用方法有比色法、免疫学方法、色谱法、电化学法等。现有的检测方法不仅可对单价多糖疫苗进行质量控制，也可对多价多糖疫苗和多糖．蛋白结合疫苗的相关指标进行检测分析。
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细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
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