原生质体培养与融合
第十二章
植物原生质体培养
本章主要内容
•原生质体培养发展简史及其意义•原生质体分离及培养
•原生质体融合
原生质体（Protoplast）•1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。
•含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活
力的裸露细胞。
植物细胞模式图
高尔基体
微丝
叶绿体
线粒体
质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成
纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
一、原生质体培养发展简史及其意义
1、发展简史
1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体；1960年：1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体；
1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场；
1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。
1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。
1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水黄瓜、杨树、云杉等；
1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；
2、原生质体培养的意义
（1）为细胞融合奠定基础。
有性杂交不能进行细胞质交流。
（2）是遗传工程的理想受体。
能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。
（3）理论研究
细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。（因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。）但是必须指出：
原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。
二、原生质体分离及培养
（一）分离方法
（二）原生质体纯化
（三）原生质体活力测定
（四）原生质体培养
（五）原生质体再生
（一）分离方法
•机械法：利刃机械切割
•酶解法：果胶酶和纤维素酶处理
1、机械分离Machanical
isolation
高度液泡化的细胞
2、酶解法
Enzymatic isolation2-1 材料
获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂，因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料。双子叶外植体/
培养细胞。单子叶植物胚性细胞。
2-3 酶液渗透压
裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入。
常用的渗透压稳定剂是糖醇系统
2-4 材料预处理
(暗处理，预培养和低温处理)
在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。
2-7 原生质体分离过程（以烟草叶片为例）
一．预处理即对烟草植株限制供水。
二．取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表
皮切成4cm的小块。
三．制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%）
并加入的0.7 mol甘露醇，0.1 mmolCaCl2，pH5.6。
四．将小块烟叶放入混合酶液25 ℃处理8~10小时。
五．过滤、离心、洗涤（0.7 mol甘露醇液含0.1
mmolCaCl2）。如此2~3次、得到原生质体。
叶片
愈伤组织
（二）原生质体纯化
•酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。
•原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种。
1、离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原
生质体沉于底部。
步骤：
•第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。•第二步离心（500~1000r/min离心
5~6min）。
•第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此2~3次。•第四步用原生质体培养液洗1次，收集原
生质体。
原生质体分离纯化流程图
2、漂浮法
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。
洗涤液：3%蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O 或11%~23%的蔗糖溶液。
（三）原生质体活力测定孢质环流法
FDA染色法
1-2、共培养法
将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合。
前者为后者提供生长因素，或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质。
第一次分裂
第二次分裂
第三次分裂多细胞团
肉眼可见的细胞团愈伤组织
三、原生质体融合
原生质体融合也叫做体细胞杂交，是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。
不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。
技术体系的3个环节：
原生质体融合；选择融合体；杂种植株的再生和鉴定
1、原生质体融合意义
——克服杂交不亲合
2、成就
1972年Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。1975年柑桔原生质体培养成功；
现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；
木本植物中柑桔最为成功。
3.1 NaNO3法
NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起.不足：诱导频率不高。
3.2 高pH-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的
50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。
不足：高pH值对细胞有毒害作用。
3.4 电融合法
Senda1979
年首先利用此方法实现原生质体融合。电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个电脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。
电融合仪
4、体细胞杂种细胞筛选
1．互补选择法（两次不同培养条件的培养）①第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。
②转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。
③两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞。
2. 荧光染料法
两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。
细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核。但仪器价格昂贵，不常用。
异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明
（RITC）分别发出绿色和红色
5、体细胞杂种的鉴定
形态学
细胞学
遗传标记