从红辣椒中分离红色素
从红辣椒中分离红色素
一、实验目的
1、了解分离天然化合物的技术与方法;
2、了解红辣椒所含色素的种类,掌握红色素的分离方法;
3、了解薄层色谱板和色谱柱的制作方法,掌握薄层色谱和柱色谱分离的一般步骤。
二、实验原理
色素作为一种着色剂,广泛应用于食品、化妆品等与日常生活密切相关的行业。天然植物色素与人工合成色素相比,因其原料来源充足,对人体无毒副作用,日益受到人们的重视,有着广阔的发展前景。红辣椒是辣椒Capsicum annum的成熟果实,含有几种色泽鲜艳的色素,主要为红色素。红辣椒色素以其色泽鲜艳、稳定性好而广泛作为食品着色剂,因此,研究红辣椒色素中红、黄色素的提取、分离和分析方法,将具有重要的现实意义和社会意义。 物质提纯方法主要包括萃取法,色谱分离法和蒸馏法。
萃取法的原理:利用物质在两种互不相溶(或微溶)溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离、提取或纯化目的的一种操作。自固体中萃取化合物,通常是用长期浸出法,靠溶剂长期的浸润溶解而将固体物质中的需要成分浸出来。萃取溶剂的选择,应根据被萃取化合物的溶解度而定,同时要易于和溶质分开,所以最好用低沸点溶剂。每次使用萃取溶剂的体积一般是被萃取液体的1/5~1/3,两者的总体积不应超过分液漏斗总体积的2/3。
色谱分离法的原理:根据样品混合物各组分在不同的两相(固定相和流动相)中溶解、解析、吸附、脱附,或其它亲和作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力的不同而以不同的速度在固定相上移动,从而得到互相分离。 柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可
以从柱上分别洗出并收集。
薄层色谱法简称TLC,是一种微量、快速、简单的分析分离方法。将吸附剂均匀地涂在玻璃板上作为固定相,经干燥活化后点上样品,以具有适当极性的有机溶剂作为展开剂(即流动相)。当展开剂沿薄层展开时,混合样品中易被固定相吸附的组分(即极性较强的成分)移动较慢,而较难被固定相吸附的组分(即极性较弱的成分)移动较快。经过一定时间的展开后,不同组分彼此分开,形成互相分离的斑点。它不仅适用于少量样品(几到几十微克甚至0.01微克)的分离,而且也适用于较大量样品(可达500毫克)的纯化。此法对于挥发性较小,或在较高温时易变化而不能用气相色谱法分析的物质特别适用。薄层色谱也可用于鉴别某些有机物。
三、仪器及试剂
仪器:100 ml圆底烧瓶、薄层色谱板、色谱柱、广口瓶
试剂:二氯甲烷、乙醇等
四、实验步骤
1、粗红色素的制取
称取3g红辣椒研碎放入100ml的圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷和沸石,加热回流30分钟。然后冷却抽滤,滤液用水浴蒸至干,即是粗红色素。
2、粗红色素的薄层层析分析
(1)薄层板的制备:铺板方法有平铺法和倾注法两种,通常使用倾注法。将调好的匀浆等量倾注在两块洗净、晾干的玻璃片上。用食指和拇指拿住玻片两端,前后左右轻轻摇晃,使流动的匀浆均匀地铺在玻璃片上,且表面光洁平整。把铺好的薄板水平放置晾干,再移入烘箱内加热活化,调节烘箱缓缓升温至110℃恒温半小时,取出放在干燥器中冷却备用。
(2)点样:取薄层板,在其一端离边沿1.0厘米处用软铅笔轻轻划一点样线。点样时应选择管口平齐的玻璃毛细管,吸取少量所制得的粗红色素置小锥形瓶中,再加5~10滴二氯甲烷配成溶液(也可取上述滤液),以毛细管取溶液点样,轻轻接触薄层板点样处,如一次点样不够,可待样品溶剂挥发后,再点数次,但应控制样品的扩散直径不超过2毫米。
(3)展开:薄层色谱需要在密闭的容器中展开(层析缸或广口瓶),将配好的展开剂(石油醚/乙酸乙酯 1:2)倒入层析缸(液层厚度约为0.5厘米)。将点好样品的薄层板放入缸内,点样一端在下(注意样品点必须在展开剂液面之上)。盖好缸盖,此时展开剂即沿薄层上升。当展开剂前沿上升到距薄层板顶端1厘米左右时,取出薄层板,尽快用铅笔标出前沿位置,然后置通风处晾干,或用吹风筒吹干。
(4)Rf值的计算:Rf值也是有机化合物的物理常数。当实验条件严格控制时,每种化合物在选定的固定相和流动相体系中有特定的Rf值。因此可利用薄层色谱进行化合物的鉴定。一个化合物在薄层板上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的Rf值:化合物移动的距离/展开剂移动的距离。
3、粗红色素的柱层析分离
(1)装柱。可以湿柱,也可以干柱。用干法装柱,将8克硅胶(100~200
目)装填到以装有10ml二氯甲烷的带旋塞的滴管或层析柱中就,排出
气泡,添匀添平,再加少许干净的砂粒(约3min)。然后旋开旋塞放出
部分二氯甲烷使其液面降至砂层的上层面。用湿法装柱,将8克硅胶用
二氯甲烷调成糊状后,徐徐倒入柱中,用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部,
使填装紧密,当装柱至3/4时,再在上面加一层厚0.5cm的石英砂,操
作时一直保持上述流速注意不能使液面低于砂子的上层 。
(2)加样品。当溶剂液面刚好流至石英砂面时,立即沿柱壁加入1ml
粗提的辣椒红溶液,当此溶液流至接近石英砂面时,立即用二氯甲烷洗
下管壁的有色物质,如此连续2~3次,直至洗净为止。上柱子就是样
品层比较薄,这样相对的减小了分离的难度。
(3)洗脱。用二氯甲烷淋洗(脱)色素(层析柱中会出现色环)。以二
氯甲烷为溶剂洗脱,控制流出速度如前。整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。β胡萝卜素因极性小首先向下移动,极性较大的叶绿素、叶黄素和辣椒红色素则留在柱的上端,形成不同的色带。当最先下行的色带快流出时,更换另一接受瓶,继续洗脱,至滴出液近无色为止,再换一接受瓶。收集洗脱液每份2ml,当红色素洗脱后,可停止淋洗(也可继续淋洗出第二组分黄色素再停)。将含有相同组分的溶液合并蒸至干纯红色素(或黄色素)。
(4)回收洗脱液。
4、红色素的鉴定
将制得的纯红色素配少量溶液进行薄层析鉴定,如果只有一个点且Rf值与前测相同则说明已得到了纯红色素。
五、注意事项
(1)点样时,样品液的浓度要适宜。浓度太高易引起斑点拖尾,浓度太低则由于体积大引起斑点扩散。点与点之间,相距为1厘米左右,斑点大小以直径2毫米为宜。
(2)展开后,取出薄板立即在展开剂前沿划出标记,如不注意,展开剂挥发后,无法确定其上升的高度。也可先划出前沿,待展开剂到达时立即取出。晾干时溶剂仍可扩散一段距离,计算Rf值时不计算在内,所以晾干时一定要水平放置,防止出现这种情况。
(3)薄层吸附色谱展开剂的选择,原则上和吸附柱色谱洗脱剂的选择类似,主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素综合考虑。展开剂的极性越大,对化合物的洗脱能力越强,Rf值也越大。薄层色谱用的展开剂绝大多数是有机溶剂。
(4)现在的柱子径高比一般在1:5~10。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物,但是比硅胶要贵些。
(5)柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的。
(6)干法和湿法装柱没什么区别,只要能把柱子装实就行。大多数情况下有些小气泡没太大的影响,柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,甚至作废!
六、思考题
1、薄层色谱分析中如何选择展开剂?
2、什么是比移值R?如何计算? f
3、装柱时为什么要把硅胶添匀填平?
4、粗红色素提取时,在水浴加热回流实验中为何温度要控制在50 ºC以下?
5、填充硅胶柱时,为何要在柱子下端塞上脱脂棉?要注意哪些问题?
2、什么是比移值R?如何计算? f
3、装柱时为什么要把硅胶添匀填平?
4、粗红色素提取时,在水浴加热回流实验中为何温度要控制在50 ºC以下?
5、填充硅胶柱时,为何要在柱子下端塞上脱脂棉?要注意哪些问题?
果胶的提取
一、目的要求
1.学习从柑橘皮中提取果胶的方法。
2.进一步了解果胶质的有关知识。
二、实验原理
果胶物质广泛存在于植物中,主要分布于细胞壁之间的中胶层,尤其以果蔬中含量为多。不同的果蔬含果胶物质的量不同,山楂约为6.6%,柑橘约为0.7~
1.5%,南瓜含量较多,约为7%~17%。在果蔬中,尤其是在未成熟的水果和果皮中,果胶多数以原果胶存在,原果胶不溶于水,用酸水解,生成可溶性果胶,再进行脱色、沉淀、干燥即得商品果胶。从柑橘皮中提取的果胶是高酯化度的果胶,在食品工业中常用来制作果酱、果冻等食品。
三、实验器材
恒温水浴、布氏漏斗、抽滤瓶、玻棒、尼龙布、表面皿、精密pH试纸、烧杯、电子天平、小刀、真空泵、
柑橘皮(新鲜)。
四、实验试剂
1.95%乙醇、无水乙醇。
2.0.2 mol/L盐酸溶液
3.6 mol/L氨水
4.活性炭
五、操作步骤
1.称取新鲜柑橘皮20 g(干品为8 g),用清水洗净后,放入250 mL烧杯中,加120 mL水,加热至90 ℃保温5~10 min,使酶失活。用水冲洗后切成3~5 mm大小的颗粒,用50 ℃左右的热水漂洗,直至水为无色,果皮无异味为止。
每次漂洗都要把果皮用尼龙布挤干,再进行下一次漂洗。
2.将处理过的果皮粒放入烧杯中,加入0.2 mol/L的盐酸以浸没果皮为度,调溶液的pH 2.0~2.5之间。加热至90 ℃,在恒温水浴中保温40 min,保温期间要不断地搅动,趁热用垫有尼龙布(100目)的布氏漏斗抽滤,收集滤液。
3.在滤液中加入0.5%~1%的活性炭,加热至80 ℃,脱色20 min,趁热抽滤(如橘皮漂洗干净,滤液清沏,则可不脱色)。
4.滤液冷却后,用6 mol/L氨水调至pH 3~4,在不断搅拌下缓缓地加入95%酒精溶液,加入乙醇的量为原滤液体积的1.5倍(使其中酒精的质量分数达50%~60%)。酒精加入过程中即可看到絮状果胶物质析出,静置20 min后,用尼龙布(100目)过滤制得湿果胶。
5.将湿果胶转移于100 mL烧杯中,加入30 mL无水乙醇洗涤湿果胶,再用尼龙布过滤、挤压。将脱水的果胶放入表面皿中摊开,在60~70 ℃烘干。将烘干的果胶磨碎过筛,制得干果胶。
六、注意事项
1.脱色中如抽滤困难可加入2%~4%的硅藻土作助滤剂。
2.湿果胶用无水乙醇洗涤,可进行2次。
3.滤液可用分馏法回收酒精。
七、问题与思考
1.从橘皮中提取果胶时,为什么要加热使酶失活?
2.沉淀果胶除用乙醇外,还可用什么试剂?
3.在工业上,可用什么果蔬原料提取果胶?