几种放线菌处理后对猪粪中主要病原菌和恶臭产生菌的影响研究
农业环境科学学报2007,26(5):1958-1962
JournalofAgro-EnvironmentScience
几种放线菌处理后对猪粪中主要病原菌和恶臭产生菌的影响研究
黄
灿1,
唐新燕2,李
季3,彭绪亚1
(1.重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400045;2.重庆大学生物工程学院,重庆400044;3.中国农业大学资源与环境学院,北京100094)
摘要:采用室内培养方法,研究评估了细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)、抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus)、灰色链霉菌
(Streptomycesgriseus)三种放线菌及其组合对猪粪中主要病原菌的影响,并对其体外的抑菌作用机理进行了初步探讨。结果表明,接菌处理能有效减少猪粪中的沙门氏菌(Salmonellaspp.)、病原性大肠埃希氏菌(EscherichiacoliO157)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterspp.)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenos)的数量。与对照组相比,单独添加细黄链霉菌组后猪粪中空肠弯曲杆菌的数量从3.1×・放线菌胞内外活性混合物质的体外抗菌试验的结果显示,不管是单独处理还是101cfug-1降至不可检测。几种放线菌的复合处理都对供试的大肠杆菌、梭菌、优杆菌、沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌表现出一定程度的抑制作用,在抑菌能力方面,单独添加细黄链霉菌的效果优于其他各组。
关键词:细黄链霉菌;抗生链霉菌;灰色链霉菌;猪粪;病原菌;放线菌胞内外活性混合物质;抑菌作用中图分类号:X172
文献标识码:A
文章编号:1672-2043(2007)05-1958-05
EffectofActinomycetesonMainPathogenicBacteriaandOdor-producingBacteriafromSwineManure
HUANGCan1,TANGXin-yan2,LIJi3,PENGXu-ya1
(1.KeyLaboratoryoftheThreeGorgesReservoirRegion’sEco-environment,MinistryofEducation,ChongqingUniversity,Chongqing400045,China;2.CollegeofBioengineering,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China;3.CollegeofResourceandEnvironmentScience,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100094,China)
Abstract:Inthelastdecades,theintensificationofhogfeedingoperationshasresultedintheproductionoflargequantitiesofwasteinasmallarea.Thewastescanresultinodor,globalwarminggasesandthetransferofpathogenstowaterandfoodchains.OurpreviousstudiesshowedthatStreptomycesmicroflavus,Streptomycesantibioticus,Streptomycesgriseusaloneandincombinationscouldeffectivelyreducetheemissionsofshortchainvolatilefattyacids(VFAs)suchasvalericacidsandiso-valericacidswhichisregardedasodorindicatorinswinemanure,andinhibitthegrowthofsuchVFAs-producingbacteriaasClostridiaandEubacteria.Inthispaper,endocellualarandextracellularactivemixedsubstancesofthreeactinomycetesS.microflavus,S.antibioticus,S.griseusandtheircombinationswerepreparedforstudyingtheantibacterialeffectmechanismsoftheseactinomycetesinvitro.TheresultsshowedthattheseactinomycetescouldreducethenumberofmainpathogenicbacteriasuchasSalmonellaspp.,EscherichiacoliO157,Campylobacterspp.andListeriamonocytogenosfromswinema-
・101CFUg-1tonodetection,Salmonellaspp.from5.8×102to0.03×nure.Comparedwiththecontrol,Campylobacterspp.reducedfrom3.1×
102afteraddingS.microflavusalonetoswinemanure.Theinvitroantibacterialeffectofendocellularandextracelluaractivemixedsubstancefromthreeactinomycetesindicatedthatwhetheractinomycetealoneorincombinations,addingactinomycetestoselectedbacteriahadan-tibacterialeffecttosomeextentonColiform,Clostridia,Eubacteria,Salmonellaspp.,EscherichiacoliO157,Campylobacterspp.,andListeriamonocytogenos.AddingS.microflavusalonetoselectedbacteriahadthebestantibacterialeffectinvitroasfarasendocellularandextracel-luaractivemixedsubstanceamongthesetreatedgroups.Theseactinomycetesmaybeusedasantimicrobialagentstocontrolpathogensandodorinstoredswinemanure.
Keywords:Streptomycesmicroflavus;Streptomycesantibioticus;Streptomycesgriseus;swinemanure;pathogenicbacteria;endocellularandextracelluaractivesubstance;antibacterialeffect
收稿日期:2006-11-19
基金项目:国家“十五”科技攻关项目(2002BA516A07)作者简介:黄
灿(1977—),男,博士,主要从事固体废弃物处理与资源化方面的教学与研究工作。E-mail:huangcancau@163.com
第26卷第5期农业环境科学学报
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集约化畜禽养殖业在提高生产效率、降低生产成本和提供优质畜禽产品的同时,也由于生产的过分集中没有过多的土地消纳畜禽粪便资源导致氮素损失,恶臭化合物的排放、地下水和地表水污染、病原菌的传播而引起人们的关注[1]。目前,大多数研究者把焦点放在畜禽粪便中的氮素损失、磷的淋溶上,对畜禽粪便导致的恶臭、畜禽粪便引发的生物污染方面关注很少。畜禽环境问题的产生大多与畜禽废弃物中微生物代谢活动有关[2],如果能抑制微生物活动必将大大减轻畜禽废弃物对环境的危害。近几年来,微生物接种本研究共分7个组,包括:添加10%(m/m)无菌水对照组(简称:对照,下同);10%(m/m)细黄链霉菌组(简称:细黄,下同);10%(m/m)抗生链霉菌组(简称:抗生,下同);10%(m/m)的灰色链霉菌组(简称:灰色,下同);5%(m/m)细黄链霉菌与5%(m/m)抗生链霉菌复合组;5%(m/m)细黄链霉菌与5%(m/m)灰色链霉菌复合组;3.3%(m/m)细黄链霉菌、3.3%(m/m)抗生链霉菌和3.3%灰色链霉菌复合组。以上各组,每组均为3个重复。
1.3猪粪中主要病原菌的测定
剂在废弃物处理方面取得了较大进展,各种功能性菌剂层出不穷,但接菌处理后对畜禽废弃物中病原菌及恶臭产生菌影响的研究少见报道。本文探讨了细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)、抗生链霉菌(Strepto-
mycesantibioticus)和灰色链霉菌(Streptomyces
griseus)三种放线菌及其组合处理后对猪粪中主要菌
群的影响,为放线菌在猪粪等畜禽粪便的资源化应用方面提供技术依据。
1材料与方法
1.1试验材料
新鲜猪粪(含水量72%;C/N10.2)取自中国农科院畜牧所养猪场。玉米秸秆(含水量4%;C/N58)来自中国农业大学科学园,粉碎。细黄链霉菌原始菌种来自中国农科院农业微生物菌种保藏中心;抗生链霉菌和灰色链霉菌原始菌株则来自于中国科学院微生物所菌种保藏中心。本试验所用的出发菌株为紫外线诱变处理的突变菌株。其中灰色链霉菌用的是PDA琼脂;细黄链霉菌和抗生链霉菌用的是高氏一号培养基[3]。以上各菌在30℃的恒温摇床上培养5d,有效活菌数不少于1.8×106个・mL-1。
1.2试验设计
考虑到原始猪粪的C/N失调和猪粪还田后作物对各种养分(N、P、K)的实际需求比例,本试验添加玉米秸杆粉(粉碎至15 ̄20目)调节猪粪的C/N比值至
25 ̄30,水分控制在60%左右。将采集的新鲜猪粪(每
瓶600g)与玉米秸秆粉混合后,置于3L已灭菌的三角瓶中,用4层医用纱布封口,在室温30 ̄37℃条件
下培养。目前,畜禽粪便等固体废弃物微生物处理的接种量并没有统一的标准,小至0.05%大至10%的接种量都有文献报道[4 ̄7]。鉴于猪粪中本身含有许多杂菌,在参考国内外堆肥接种剂接种量的基础上,考虑本研究的实际,设置了如下的试验组合。
试验结束后,采用标准方法[8]从猪粪中分离出沙门氏菌(Salmonellaspp.)、空肠弯曲杆菌(Campylobac-
terspp.)、病原性大肠埃希氏菌(EscherichiacoliO157)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocy-
togenos),并对其进行鉴定和计数。1.4猪粪中主要恶臭产生菌的分离
试验结束后,用选择性培养基分离猪粪中的梭菌(Clostridia)、优杆菌(Eubacteria)、大肠杆菌(Col-
iform)。梭菌用的是Clostrisel琼脂;优杆菌用的是改
良的ES琼脂;大肠杆菌用的是EMB琼脂[9]。1.5放线菌胞内外活性混合物质的体外抑菌试验1.5.1菌体胞内外活性混合物质的制备
胞外:3种放线菌液体发酵后,5000r・min-1离心
5min,上清液用细菌过滤器过滤,过滤液为菌体胞外活性物质(为确保是无菌的,取1mL处理液,接种在PDA培养基上,培养2d,观察有无微生物的生长,若
有,再做无菌过滤试验,直到无菌为止)。
胞内:5000r・min-1离心5min,沉淀物在冰浴下加无菌石英砂研磨,补充水分,使液体体积与原来相同,再5000r・min-1离心5min,上清液用细菌过滤器过滤,过滤液为菌体胞内活性物质(为确保是无菌的,取1mL处理液,接种在PDA培养基上,培养2d,观察有无微生物的生长,若有,再做无菌过滤试验,直到无菌为止)。
各自制备好菌体胞内和胞外活性物质后将其两者进行混合即为菌体胞内外活性混合物质。
1.5.2菌体胞内外活性混合物质的体外抑菌试验
供试菌种的培养与制备:将大肠杆菌接种在牛肉膏蛋白胨斜面上,37℃下培养24h;将从猪粪中分离的梭菌和优杆菌分别培养在Clostrisel琼脂和ES琼脂上,严格厌氧的条件下培养72h;空肠弯曲杆菌在微好氧条件下(5%O2、10%CO2和85%N2)在增菌肉汤中42℃下培养48h;单核细胞增生李斯特氏菌在EB
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黄灿等:
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增菌液中30℃下培养72h;沙门氏菌在SC增菌液中病原菌的数量与屠宰后的畜体污染之间存在着一定的相关性。未经处理的粪便含有许多病原性微生物,在环境中能存活很长时间,甚至在田间施用后仍然生存,这不仅直接威胁畜禽自身的生存,还会严重危害人体健康。未经处理的粪便在贮存或施到田间后,其中的致病性微生物可能随径流水进入灌溉或饮用水水源,或通食物链导致人体患病。Howell[12]研究了放牧场粪便中致病微生物对周边水源污染的影响,结果表明,水井及泉水中粪便微生物数量超过国家标准的
37℃下培养24h;病原性大肠埃希氏菌在增菌营养
肉汤中42℃下培养18h。以上的大肠杆菌、梭菌、优杆菌培养后分别用5mL无菌水洗下,制成菌悬液,备用。空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌通过各自适宜的增菌培养液培养后直接作为菌悬液备用。
菌体胞内外活性混合物质抑菌试验:采用液体扩散法,分别吸取各供试菌的菌悬液0.5mL接入相应供试菌的琼脂平板上并用玻棒涂匀。选择吸水性强的新华Ⅰ号滤纸,用打孔器制成直径为6mm的小滤纸片,干热灭菌后用无菌镊子将其浸入已制备的菌体胞内和胞外的混合物中,备用,将含有放线菌菌体活性物质的滤纸片贴于含供试菌悬液的平板上。大肠杆菌菌悬液置于37℃下好氧培养24h;梭菌和优杆菌菌悬液置于37℃下厌氧培养72h;空肠弯曲杆菌的菌悬液在微好氧条件下42℃下培养48h;单核细胞增生李斯特氏菌的菌悬液在30℃下培养72h;沙门氏菌菌悬液在37℃下培养24h;病原性大肠埃希氏菌的菌悬液在42℃下培养18h。各处理组培养后用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小,结果取平均值。
28% ̄74%,小溪超标87%。
抗生链霉菌和灰色链霉菌在药物生产中主要作为抗生素的产生菌,用于猪粪的处理尚未见相关报道。细黄链霉菌是1953年中国农科院土肥所分离的一个菌种,以往主要用于生产“抗生菌肥。尽管5406”近几年来有关细黄链霉菌用于畜禽粪便处理也有相
14]关报道[13、,但这些报道多集中在接菌处理后对粪便
中铵态氮的影响,细黄链霉菌处理后对粪便中病原菌的影响少有研究。本研究结果表明(表1),放线菌处理后能减少猪粪中的沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌的数量。在这些放线菌及其组合当中,单独添加细黄链霉菌在降低所测的4种病原菌数量方面都显示了最优的效能。与对照组相比,单独添加细黄链霉菌组的猪粪中沙门氏菌数量从5.8×・・102CFUg-1降至0.03×102CFU・g-1,空肠弯曲杆菌的数量从3.1×101CFUg-1降至不可检测,单核细胞增生李斯特氏菌的数量从4.7×102
・・CFUg-1降至0.14×102CFUg-1,病原性大肠埃希氏菌的数量从2.1×・・103CFUg-1降至1.7×101CFUg-1。2.2放线菌胞内外活性物质的体外抑菌作用
猪粪中含有许多杂菌,Al-Kanani[15]研究表明,微生物接种剂使用成功的关键是使接入的菌剂成为粪便中的优势菌群,至少接入的菌剂能生长繁殖,变成本土菌群的一部分。目前,动态观察微生物接种剂在
2结果与分析
2.1放线菌处理后对猪粪中主要病原菌的影响
畜禽粪便中含有大量的病原微生物和寄生虫卵,特别是非冬季节,畜禽粪便孳生大量的蚊蝇,从而造成人、畜传染病和寄生虫蔓延。据资料报道每毫升畜禽场排放的污水中平均含有83万个大肠杆菌,69万个肠球菌,还含有寄生虫卵和活性较强的沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等病原菌
[10]
。Elderetal.[11]的研究发现,
28%的牛粪含有致病性的E.coliO157,11%送往屠宰场的牛毛皮上发现了E.coliO157,这显示了粪便中的
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畜禽粪便中生长情况的手段有:16SrRNA/rDNA序列分析技术、分子标记技术、生物芯片等[16]。这些分子生物学检测方法灵敏度高,但也存在着技术含量高,操作复杂、费时等缺点。鉴于动态掌握某一种或某几种菌剂在人、畜禽体内或畜禽粪便中的难度,实践中常制备一种或某几种菌剂的胞内外活性混合物质探讨其在体外对供试菌的作用,以间接了解菌剂在人、畜禽体内或废弃物处理中的使用效果。如王芳等[17]为了间接了解乳酸链球菌产生的多肽在体内对奶牛乳房炎的治疗效果,从乳酸链球菌发酵物的胞内外活性混合物质中提取了抗菌物质Nisin,研究了在体外纯培养条件下对奶牛乳房炎主要致病菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌)的抗菌作用。赵佳锐等[18]为了了解益生菌在人体肠道中的使用情况,从健康青年和儿童肠道分离了益生菌(主要是双岐杆菌和乳杆菌)探讨了发酵后的菌体胞内外活性混合物质对6种肠道病原指示菌(蜡样芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、粪肠球菌)体外抑菌效果。本研究中为了间接了解放线菌在猪粪中的生长情况,我们制备了放线菌胞内外活性混合物质(含有放线菌的代谢产物)探讨其在体外纯培养条件下对猪粪中主要本土菌群的影响。
放线菌胞内外活性物质的体外抗菌试验基本上能反映放线菌处理后在猪粪中的抑菌作用。几种放线菌的单独处理中,细黄链霉菌在体外对供试的7种菌都有较强的抑制作用(表2)。从表2还可以看出,3种放线菌的复合体外抗菌能力不如两种放线菌的组合,在所有的处理组中单独添加细黄链霉菌组表现最强的体外抗菌作用。这很可能是因为几种放线菌复合后菌体之间相互拮抗反而不利于抗菌素等产物的累积,具体原因还有待于进一步探讨。
畜禽粪便含有未消化的有机物质,如碳水化合物、蛋白质和脂肪。在需氧的情况下,碳、氮、含硫的化
合物降解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐和水。在厌氧条件下,这些有机化合物的降解则产生甲烷、二氧化碳、硫化氢、水等产物。在多数情况下,畜禽废弃物处于兼胺类(如吲哚,粪臭素,甲性厌氧状态,这导致了氨、
酚)、挥发性脂肪酸、含硫化合物、各种醇类等恶臭化合物的产生[19]。
要对恶臭定义是件困难的事,因为组成恶臭的化合物很多,收集恶臭也是件困难的事,再者用仪器分析恶臭物质的浓度与用感官法分析的恶臭强度之间硫化氢和恶臭通常缺乏相关性[20]。许多研究表明,氨、
强度之间的相关性很差[20]。然而Zahn[21]在对34个养猪场的研究中发现,空气中的短链挥发性脂肪酸酸的含量(如丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸)与猪粪中恶臭强度之间存在着最好的相关性,因而控制这些挥发性脂肪酸形成和排放将对恶臭的产生和控制有着直接的影响。
从理论上来讲,假如能减慢或阻止微生物发酵有机物的过程,将能更好的控制短链挥发性脂肪酸等恶臭气体的产生。Cottaetal.[22]采用16SrDNA技术得出猪粪中的主要菌群是低G+C%值的革兰氏阳性菌,其中梭菌、优杆菌适应生长范围广被认为在短链挥发性脂肪酸的产生过程中起着重要作用。我们在先前的研究中发现,几种放线菌处理能减少猪粪中挥发性脂肪酸(异丁酸、戊酸、异戊酸)的产生,抑制猪粪中主要恶臭产生菌(如优杆菌和梭菌)的生长,降低猪粪的恶臭强度[23]。本研究中,从猪粪中分离了主要的病原菌和主要的恶臭物质产生菌,探讨了几种放线菌的发酵培养液在体外纯培养下对以上分离菌群的抑菌作用。从表2可以看出,放线菌胞内外活性混合物质在体外纯培养时均对供试菌产生一定程度的抑制作用,这种抑菌能力的产生很可能与胞内外活性混合物质中含有一定浓度的抗菌素有关。
总体而言,
几种放线菌处理后能抑制猪粪中微生
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黄灿等:几种放线菌处理后对猪粪中主要病原菌和恶臭产生菌的影响研究2007年9月
物发酵减少猪粪中短链挥发性脂肪酸等恶臭气体的排放;抑制猪粪中的病原性大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌的生长,因而在畜禽养殖业的可持续性发展中起着重要作用。
3结论
细黄链霉菌、抗生链霉菌、灰色链霉菌及其复合组添加到猪粪后能有效减少粪中的沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌的数量。在这些放线菌及其组合当中,单独添加细黄链霉菌在降低所测的4种病原菌数量方面都显示了最优的效能。与对照组相比,单独添加细黄链霉菌组后猪粪中空肠弯曲杆菌的数量从3.1×101cfu・g-1降至不可检测。放线菌胞内外活性物质的体外抗菌试验的结果显示,不管是单独处理还是几种放线菌的复合处理都对大肠杆菌、梭菌、优杆菌供试菌表现出抑制作用,在抑制能力方面,单独添加细黄链霉菌的效果优于其他各组。
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