玉米叶片硝酸还原酶活性测定条件的优化_齐艳玲

河北科技师范学院学报 第24卷第1期, 2010年3月Journa l ofH ebeiNor m alUn i v ersity of Science &Techno logy Vo. l 24No . 1M arch 2010

玉米叶片硝酸还原酶活性测定条件的优化

齐艳玲, 马庆武, 郭守华121

(1河北科技师范学院生命科技学院, 2体育系, 河北秦皇岛, 066600)

摘要:以玉米品种农大108幼苗为材料, 研究了温度、p H 值、叶位及一天中的不同时段对硝酸还原酶(NR ) 活性的影响, 同时对光照及三氯乙酸(TCA ) 对NR 的影响效应进行了评价。结果表明, 玉米硝酸还原酶在24e , p H 7. 5下的活力最高; 不同叶位, 刚刚展开的叶片(心2叶) 活性极显著高于其它叶位; NR 在一天中的不同时段活性不同, 以15:00的活性最高。不同测定条件下, 与照光处理相比, 黑暗条件下的酶活性显著提高。此外, 加入变性剂三氯乙酸使玉米叶片内的NR 活性明显减低。

关键词:玉米幼苗; 硝酸还原酶; 测定条件

中图分类号:S513 文献标志码:A 文章编号:1672-7983(2010) 01-0032-04

硝酸还原酶(N itrate reductase , NR) 是陆生植物氮代谢的关键酶之一, 它将进入植物体内的NO 3还原为NO 2, 进而在亚硝酸还原酶(Nitrite reductase , N i R ) 的作用下还原为氨进入氮的同化。因此, NR 活性直接影响植物对土壤中硝态氮的利用能力。生产中, 硝酸还原酶活性可作为农作物氮肥形态选择的

[1~6]重要依据, 也被认为是作物氮高效的育种选种指标之一。

NR 活性除了受遗传因素的决定以外, 还受到底物浓度、光、温度、p H 、无机盐、水分和外源激素等环境因素的影响[2~5]--。因此, 阐明NR 活性的影响因素, 对进一步了解氮代谢特点及指导作物生产中合理施肥具有一定的意义。玉米是我国主栽粮食作物之一, 其生产过程历来受到很高的重视。关于玉米硝

[7]酸还原酶活性的研究, 尽管前人已对不同节位玉米叶片硝酸还原酶活性以及玉米幼叶硝酸还原酶热

稳定系数[8]等方面进行了研究, 但有关影响玉米NR 活性因素的研究还未见报道。

本试验以10~40日龄玉米幼苗为材料, 研究不同环境因素对玉米NR 活性的影响, 分析了玉米NR 发挥作用的最适条件, 以期对此酶有更进一步的了解, 并为今后玉米的氮高效生产实践提供理论依据。1 材料和方法

1. 1 材料来源

实验于2008年4~6月于河北科技师范学院生命科技学院生物技术实验室进行, 试验材料为/农大108玉米0, 盆栽培养幼苗, 栽培基质取自园林试验站, 土壤为中性壤土。

1. 2 处理因素及设计

1. 2. 1 p H 对NR 活性的影响 在预实验基础上, 设pH 为6. 0, 6. 5, 7. 0, 7. 5, 8. 0五个梯度, 旨在明确p H 值对NR 的调控效应。

1. 2. 2 温度对NR 活性的影响 在最适p H 条件下, 设置22, 24, 26, 28, 30e 不同梯度, 试验方法如上, 最终确定出玉米NR 的最适温度。

1. 2. 3 叶位对NR 活性的影响 当幼苗达到8~9片叶时, 在最适温度和最适p H 值下, 分别测定不同叶位叶片的NR 活性, 从上到下, 分别测心叶、心1叶、心2叶、心3叶、心4叶、心5叶、心6叶等7个叶位。找出这段时期酶活性最高的叶龄。

1. 2. 4 NR 活性的日变化 在最适温度和最适p H 值下, 选择无云晴天测定一天7:00, 9:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00, 19:00的心5叶的NR 活性, 分析NR 活性的日变化特征。

1. 2. 5 光照条件对NR 活性的影响 在最适温度和pH 值条件下, 设置光、暗两个处理, 测定不同照光水平对NR 活性的影响。

收稿日期:2010-02-01; 修改稿收到日期:2010-03-16

1期 33

1. 2. 6 抑制剂对于NR 活性的影响 在最适温度、最适p H 值、避光条件下, 设定对照, 测定三氯乙酸对于NR 活性的影响。

1. 3 NR 活性测定

NR 活性测定采用标准曲线法, 以对氨基苯磺酸和A -萘胺为显色剂, 以1g 鲜样在1h 内催化产生NO 2的L g 数表示酶的活性。

所有实验均设3个重复。试验数据用DPS 统计分析软件进行显著性检验(F 检验) 。-

2 结果与分析

2. 1 不同pH 值对NR 活性的影响

p H 值是影响酶活性的最重要因素之一。在一定pH 值下, 酶表现最大活力, 高于或低于此pH 值, 酶活力降低。试验结果如图1所示, 从图中可以看出, p H 为7. 5时酶活性最大, 与pH 为6. 0, 7. 0, 8. 0相比差异达到极显著水平, 与6. 5相比差异达到显著水平。

2. 2 不同温度对NR 活性的影响

在一定条件下, 每种酶都有其最适温度, 低于或高于它都会抑制酶的活性。试验结果表明, 24e 酶活性最高(图2) 。22, 26, 28, 30e 下酶活性都有不同程度的降低。研究表明, 24e 与22e 及30e 相比差异极显著, 与26e 相比差异显著, 与28e 相比差异不显著, 但28e 与26e 两者之间的差异不显著, 表明24e 是玉米NR

高活性的最适温度。

图1 不同p H 值对玉米NR 活性的影响 图2 不同温度对玉米NR 活性的影响

注:图中小写与大写字母分别表示5%和1%的显著水平(下同) 。

2. 3 不同叶龄对NR 活性的影响

不同叶位的叶片处于不同的年龄时期, 而不同龄期的叶片在生长发育状态、代谢水平、光合能力、以及在植株整体中的地位都有所不同。叶片硝酸还原酶被认为是诊断氮素营养水平和氮肥施用量多少的

[1, 6]一种间接生化指标, 因此, 其活性也可能具有叶位上的特异性。在前期试验获得的最适温(24e ) 、

最适pH (7. 5) 条件下, 研究玉米一段时期内叶位(叶龄) 与NR 活性的关系, 结果见图3。从图中可以明显看出, 随叶龄的增长, NR 活性经历了一个逐渐升高而后又降低的过程。心2叶酶活性最高, 其它叶位叶片的酶活性均低于心2叶。统计分析显示, 心2叶的硝酸还原酶活性极显著地高于其他叶位。但本试验的材料为苗期玉米, 该规律是否适用于玉米的整个生长期, 还需要延长试验周期才能确定。

2. 4 NR 活性的日变化

绿叶中的NO 3还原与光合作用的关系极为密切, 即光合作用为NO 3还原提供还原力--[10]。因此, ,

34河北科技师范学院学报 23卷 一天中的光照强度不同, 光合作用强度也不断变化, 所以, 表现出来的NR 活力也可能不断改变。

玉米硝酸还原酶日活性变化曲线见图4。从图中可以看出, 在从7:00~19:00的12h 的活性变化中, 以15:00的酶活性最高, 上午酶活性变化趋势明显增强, 但13:00有所下降, 下午酶的活性也有下降的趋势。可见15:00的酶活性显著高于17:00, 19:00的水平, 但与前边的各时段的差异均未达到显著, 表明在整个上午NR

活性一直维持在一个较高的水平。

图3 不同叶龄对玉米NR 活性的影响 图4 一天中不同时间点玉米NR 活性的变化

2. 5 测定过程中光照条件对NR 活性的影响

NR 将植物体内的NO 3还原为NO 2, 而此反应中的产物NO 2可被植物组织中另一个酶N i R 进一步还原为氨。因此要想测定NR 的活性, 必须抑制N i R 的活性。抑制这一反应的办法是将整个体系置于黑暗中, 这样叶绿体就不会产生出N i R 的必要辅酶) ) ) 铁氧还蛋白。所以反应发生时见光与否对酶活性有一定影响。

由表1可见, 硝酸还原酶酶活性在黑暗条件下高于光照条件, 且差异达到极显著。这表明, 在硝酸还原酶活性的测定中, 应严格坚持在避光条件下进行。

2. 6 TC A 对于测定结果的影响

硝酸还原酶的活性是以单位时间单位鲜重生成NO 2的L g 数来表示。因此, 反应过程的准确计时十分重要。酶的本质是蛋白质, 因此在底物充足的条件下, 要准确测定一定时间内酶的活性, 就必须在确定的反应时间结束时, 加入蛋白质变性剂, 以达到抑制酶活性的作用。本实验结果表明, 三氯乙酸加入后酶活性有所降低, 但是下降幅度并不显著(表2) 。

表1 光照与否对玉米NR 活性的影响

处理

黑暗

光照

酶活性(NO 2-) /[L g #(g #h) -1]75. 141a A 46. 328b B 表2 TCA 对于NR 活性的影响三氯乙酸+--1酶活性(NO -]2) /[L g #(g #h) ----83. 051a A 67. 232a A 注:均值后小写与大写字母分别表示5%和1%

的显著水平(下同) 。

3 结论与讨论

3. 1 玉米中NR 活性的最适温度为24e , 最适p H 值为7. 5

研究结果表明, 玉米中NR 活性作用的最适温度为24e , 说明春末夏初阶段玉米能够很好地利用土壤中的硝态氮, 而在炎热的夏季其利用能力可能下降; 最适p H 值为7. 5, 说明中性偏碱的环境有利于

在玉米生产中, 应根据生育季节的温度条件和土壤的p H 特征, 进行科学施肥。

3. 2 随着叶龄的增加玉米NR 活性先升高后降低

崔杰等[10]在对甜菜NR 活性研究发现, 各年龄叶片的硝酸还原酶活性不同, 以新近成熟叶的酶活

[11]性为最高, 可以作为研究酶活性变化的材料。本试验中, NR 活性随着叶龄变化的结果与曲文章等人研究结果一致。于海彬等认为, 造成这一现象的原因是气温和日照条件等外因共同影响所致。

本试验是在相对稳定的室内条件下进行, 发现玉米NR 活性随叶龄变化出现的单峰曲线。这可能是由于, 本试验取材的心叶, 叶片尚处于卷曲阶段, 光合色素含量及光合作用均处于很低水平, 加之幼龄期生长迅速, 很难有光合产物用于NO 3还原, 因此酶活性也很低造成的; 心1叶叶片的上半部已经展开, 但下半部仍呈鞘状包裹在幼茎上, 因此状况有所改观但改变幅度有限; 与前2片叶相比, 心2叶已全部展开, 色素含量及光合强度均有大幅度提高, 但此期叶面积尚未达到最大, 叶片细胞数目的增多及细胞体积的增大, 需要大量的蛋白质供应, 这一过程对叶片的氮代谢足以起到促进作用。此后叶面积的增长趋于平缓, 氮代谢水平处于相对较低但也较稳定的阶段。

3. 3 NR 活性测定应采用避光操作并及时进行反应的终止

还原力来自于光合作用积累的有机物进入呼吸链时产生的NADH 或者NADP H, 也就是植物光合作用大小和时间长短对酶活性有一定的影响, 光照越强, 植物光合作用越强, 积累的有机物就越多, 呼吸

[3, 6]时产生的还原力NADH 或者NADP H 也就越多, NR 活性也就越强。所以NR 酶活性日变化表现为

先升高后降低。NR 可将植物体内的NO 3还原为NO 2, 产物NO 2可接着被N i R 利用光合链末端的电子进一步还原为氨。从而使NO 2难以积累而影响NR 的活性测定, 抑制这一反应的办法需将整个体系置于黑暗中, 这样叶绿体就不会产生出N i R 的必要辅酶) ) ) 铁氧还蛋白, 阻抑N i R 的活性, 所以避光操作是十分必要的。三氯乙酸作为蛋白质的沉淀剂, 常用于限时反应中终止酶的活性。从实验原理上NR 活性测定中加入三氯乙酸是完全必要的, 其重要价值在于缩小反应的时间误差, 也只有这样才符合NR 活性的定义。本试验中加入三氯乙酸后比不加的酶活性有所降低, 差异方向符合实验原理, 但是差异不显著。尤其在样品数量大、试验时间长的情况下, 如没有三氯乙酸控制时间, 势必会导致误差增大, 使实验结果失去可信性。

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[10] 崔杰, 曲文章. 甜菜硝酸还原酶活性的研究[J].甜菜糖业, 1990(1):6-9.

[11] 于海彬, 蔡葆, 孙国琴. 甜菜硝酸还原酶活性的研究[J].中国甜菜, 1993(3):18-23. -----[4, 7, 8]

作者简介:齐艳玲(1967-), 女, 副教授。主要研究方向:从事植物生理化学分析测试研究。

(责任编辑:石瑞珍)

(下转至第44页)

t h e econo m ic thresho l d , and reduce the pesticide residues on chestnut through the dose a llo w ed by the govern -m ent ad m i n istrati o n .

K ey w ords :Castanea m o llissi m a ; insect pests ; contro; l m on itor i n g ; research advance

(上接第31页)

Populati o n Dynam ics ofM ain P ests and N at ural Ene m ies i n Transgenic BADH R ice

GAO Su-hong , Z HAO Chun -m i n g , LI Shu -fang , JI Zh-i x i n , S HAO Y i n g -y i n g

(1Co llege of B i o l o gy Sc ience , H ebe iNor m a lUniversity o f Sc i e nce&Techno l o gy ,

Q i n huangdao H ebe, i 066600; 2TheM ain Schoo l o fVocational and Adult Education, Bazhou H ebe; i China) Abst ract :E ffects of transgenic BADH rice on population dyna m ics of pests and natural ene m ies w ere studied by populati o n eco l o g ical pri n ciple . The results suggested that t h e co mposition of pests and ene m ies w ere si m -i lar bet w een the p l o ts of transgenic r i c e and its parenta l line (zhonghua 8), but w ith d ifferent accumu lated nu m bers for each strain . Pests and ene m iesw ere d ifferent i n different transgenic rice . Bu t co m pared w ith the ck , this d ifferentw as not si g nifican. t Popu lation dyna m ics o f the m ai n pests and ene m ies show ed that the pop -u lation peak o f C icadula fascii f rons , Sogatella furcifera, Caphalocrocis m edinalis occurred fro m late Ju ly , m i d to late Ju l y and earl y Septe m ber . M is um enop s tricus p idatus , Geocoris thicolor and Apan teles cyp ris w ere si m ilar w it h the m ai n pests i n the population peak . Ene m y -insect fo llo w ing pheno m enon w as obv i o us . There w asn . t si g nifican t d ifference bet w een each treat m en. t Th i s ind i c ated that there w asn . t obv ious negative e ffect o f trans -genic rice on the populations o f the m a i n pests and nat u ral ene m ies .

K ey w ords :transgen ic B AD H rice ; pest i n sects ; natura l ene m ies ; popu lati o n dyna m ics ; safety evaluati o n 11211(上接第35页)

The Opti m acal Param eter Exa m ination Syste m of N itrate R educt ase A ctivit y in C orn Leaves

Q I Yan -li n g , MA Q i n g -w u , GUO Shou -hua

(1School of life sc i e nces and techno logy , 2Depart m ent of Physical Education ,

H ebe iNor m alUn i v ersity of Sc ience and Technology , Q i n huangdao H ebe, i 066004, Ch i n a)

Abst racts :The effects o f p H, te m perat u re , leave positi o n , different ti m e during the day , illu m i n ati o n and TC A on the n itrate reductase activ ity of the corn leaves of Nongda 108seedling w ere stud i e s . The results sho w ed that the opti m um pH and te m perat u re were 7. 6and 30e respecti v e l y . On the d ifferent positi o ns o f t h e leaves , the NR activ ity o f heart 2leafw as sign ificantly higher t h an other positions . Enzy m atic activity w as t h e highest at 15o c ' lock duri n g the day ti m e . I n t h e deter m i n ation process , the enzy m e activ ity w as sign if-i cantly higher under the dark cond iti o n than under the li g ht condition . The additi o n o f trichloroacetic ac i d (TC A ) after heat preser vati o n si g nifican tl y lo w ered t h e enzy m e activ ity o f the corn leaves .

K ey w ords :corn seed ling ; nitrate reductase ; i n fluenc i n g factor 121