红花等10种中药的植物雌激素活性研究_赵丕文
第32卷第5期
2007年3月
Ch i n a Journa l of Ch i n ese M a ter i a M ed i ca
中国中药杂志
Vol . 32, Issue 5March, 2007
红花等10种中药的植物雌激素活性研究
赵丕文, 王大伟, 牛建昭, 王继峰, 王玲巧
(北京中医药大学基础医学院, 北京100029)
[摘要] 目的:评价红花、川牛膝、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等10味中药的植
3
物雌激素活性。方法:选用昆明种雌性乳鼠, 随机分为A, B 二组:A 组又分为12组(溶剂对照组、己烯雌酚组和10个中药组) ; B 组也分为12组(溶剂对照组、己烯雌酚组和10个中药拮抗组) , 其中中药拮抗组每天同时灌胃中药和己烯雌酚; 各组给药4d 后分离血清。利用雌激素受体(ER ) 阳性MCF 27细胞, 以MTT 法检测中药含药血清对细胞增殖的影响。结果:A 组中, 红花、川牛膝、丹参、枸杞、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子等中药含药血清可显著促进MCF 27细胞增殖; 而女贞子组可见细胞增殖受到明显抑制。B 组中, 红花、川牛膝、丹参、甘草、淫羊藿、补骨脂和菟丝子组可见己烯雌酚促细胞增殖的作用受到了显著抑制; 作用。结论:红花、川牛膝、丹参、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等6, 在与雌激素同时用药时具有抗雌激素作用, 。
[关键词] MTT 法; ; 2[]1]A 100125302(2007) 0520436204
植物雌激素phyt oestr ogen ) 可以与哺乳类动物
及人类的雌激素受体(estr ogen recep t or, ER ) 相结合并将其激活, 在体内具有双向调节作用, 即:当体内雌激素水平较高时发挥抗雌激素活性; 而体内雌激
[1]
素水平较低时具有拟雌激素作用。
实验研究表明:某些中药在发挥其雌激素样作用的过程中, 对含有雌激素受体的肿瘤细胞增殖也有显著的影响。因此, 本实验利用乳腺癌MCF 27细胞增殖实验, 观察10种妇科常用中药:红花、川牛膝、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等对肿瘤细胞增殖的作用, 评价其植物雌激素活性, 为指导临床妇科用药, 特别是为更年期妇女保健与雌激素依赖性肿瘤(如乳腺癌、前列腺癌等) 患者的用药提供参考。1 材料
1. 1 动物 昆明种小鼠240只, 雌性, 出生后21d (刚断乳) , 体重9~12g, 购自北京维通利华实验动物
实验期间饲喂在二级动物室, 温度(25±1) ℃。
1. 2 药物、试剂和细胞株 红花、川牛膝、丹参、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等10种中药为免煎剂, 江阴天江药业有限公司生产,
批号0505033, 购自北京东直门医院中药房, 实验时用双蒸水溶解, 生药含量为250mg ・mL 。阳性药物为己烯雌酚, 北京益民药业有限公司生产, 批号
-1
0504100, 制成30μg ・mL 的悬浊液。DME M (高糖) 、无酚红DME M (高糖) 、活性炭2葡聚糖苷处理的胎牛血清(CDT 2F BS ) 为Hycl one 公司产品; 小牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所; MTT, DMS O 为Sig ma 公司产品。人乳腺癌MCF 27细胞株为清华大学生命科学学院程龙博士惠赠。1. 3 仪器 酶联免疫检测仪(Tecan ) ; 倒置显微镜(O ly mpus ) 。2 方法
2. 1 分组、给药及取材 将动物按体重均衡和随机
-1
技术有限公司(动物合格证号:S CXK 京200222003) 。
[收稿日期] 2006206210
[基金项目] 国家自然科学基金(30371775, [1**********]) ; 国
家长江学者和创新团队发展计划(I RT0413) ; 教育部博士点基金
([1**********])
[通讯作者] 3牛建昭, Tel:(010) 64287538, E 2mail:niujjzz@263. com
的原则分为A, B 二大组:A 组观察中药的雌激素样作用, 共分为12组(正常对照组、阳性药对照组和10个中药组) , 每组10只; B 组观察中药对阳性药物己烯雌酚的拮抗作用, 也分为12组(正常对照组、阳性药对照组和10个中药拮抗组) , 每组10只。A, B 组中的阳性药对照组每天按0135mg ・kg 给
-1
予己烯雌酚; A 组的10个中药组每天按3g ・kg
-1
・436・
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灌胃中药; B 组的10个中药拮抗组每天同时灌胃中
药(剂量同A 组) 及己烯雌酚(剂量同阳性药对照组) ; 正常对照组给予等体积蒸馏水。灌胃分早、晚两次进行, 给药均持续4d 。各组动物于最后一次给药后第2天眼眶取血, 4℃存放过夜; 2000r ・
-1
m in 离心10m in, 小心分离血清, 56℃30m in 灭活补体, 0122μm 微孔滤膜过滤, -20℃贮存备用。2. 2 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF 27, 培养在含10%小牛血清的DME M 高糖溶液中, 培养条件为37
个复孔。分别于24, 48, 72h 时, 加入MTT (5mg ・
-1
mL , 15μL /孔) , 继续孵育4h, 吸去培养液, 每孔加入DMS O 150μL, 震荡5~10m in, 使结晶物完全溶解; 用酶联免疫检测仪在570n m 下测定各孔吸光度(A ) , 计算平均A 值和增殖率(PR ) 。
PR =实验组A 值/正常对照组A 值×100%
2. 4 数据统计 实验结果均用x ±s 表示, 用SPSS 1010软件进行数据处理, t 检验进行统计学分析。3 结果
3. 1 10种中药含药血清对MCF 27细胞增殖的影响
℃, 5%CO 2, 相对饱和湿度。实验开始前4d 将细胞
用P BS 洗涤2次后, 改为在无酚红DME M (含5%CDT 2F BS ) 中培养, 以耗尽细胞内储存的雌激素。2. 3 MTT 细胞增殖试验 MCF 27细胞经无酚红DME M (含5%CDT 2F BS ) 培养4d 后, 选取对数生长
期细胞, 用0125%胰蛋白酶消化, P BS (pH 714) 洗3
次, 加入无血清DME M , 以2/于96孔板。药物血清的, 6
剂量
/g・kg -1-[1**********]333
[***********][***********][1**********]7
A
表1显示, 给予己烯雌酚可诱发MCF 27细胞增殖显著加快, 并存在明显的时间依赖性。除甘草外, 其余8种中药(红花、川牛膝、、枸杞、肉苁蓉、淫、) MCF 2, ; 而女, 结果显示其增殖幅度在h 时均低于正常对照组(P
3. 2 10种中药拮抗雌激素作用含药血清对MCF 27
48h
72h
PR /%
A
表1 10种中药含药血清对MCF 27细胞增殖的影响(x ±s, n =6)
组别正常
已烯雌酚红花 川牛膝 丹参 女贞子 枸杞 甘草 肉苁蓉 淫羊藿 补骨脂 菟丝子
24h
PR /%
A
PR /%
±0103±01012) ±01012) ±01032) ±0103±01042) ±01042) ±01031) ±01032) ±01042) ±01042)
)
±01012
[***********][***********][***********][***********][***********][1**********]149±0106±01042) ±01042) ±01081) ±01062) ±0108±01092) ±0107±01112) ±01091) ±01072)
)
2
[***********][***********][***********][***********][***********][1**********]177±0107±01042) ±01102) ±01062) ±01062) ±01042) ±01082) ±0107±01102) ±0113±01112)
)
2
[***********][***********][***********]56144 注:与正常组相比1) P
表2 10种中药拮抗雌激素作用含药血清对MCF 27细胞增殖的影响(x ±s, n =6)
组别
正常已烯雌酚
红花+已烯雌酚川牛膝+已烯雌酚丹参+已烯雌酚女贞子+已烯雌酚枸杞+已烯雌酚甘草+已烯雌酚肉苁蓉+已烯雌酚淫羊藿+已烯雌酚补骨脂+已烯雌酚菟丝子+已烯雌酚
剂量
-[1**********]333
-1
24h
A
48h
PR /%
A
72h
PR /%
A
PR /%
[***********][***********][1**********]5±0105±0107±0108±01042) ±0105±0105±0102±0105±0106±0107±0110±01051)
[***********][***********][***********][***********][***********][1**********]124±0107±0104±01062) ±0106±0103±0110±0103±01082) ±0106
)
±01082±01042) 2)
[***********][***********][***********][***********][***********][1**********]3±0107±0106±01082) ±01032) ±01062) ±0112±0106±01082) ±01071)
)
±01032±01052) 2)
[***********][***********][***********]00 注:与阳性药对照组相比1) P
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细胞增殖的影响 表2显示, 在动物体内有较高浓
度雌激素时, 红花、川牛膝、丹参、甘草、淫羊藿、补骨脂和菟丝子组含药血清对已烯雌酚促进细胞增殖的效应具有明显的抑制作用, 与阳性药对照组相比具显著性差异; 其中甘草的拮抗作用较为明显, 72h 时已显著低于正常对照组; 而淫羊藿、补骨脂、菟丝子3种中药与已烯雌酚共同作用时, 其含药血清不但无促增殖作用, 还对肿瘤细胞的生长产生了抑制作用。同时, 从实验结果中也可看到:肉苁蓉的雌激素效应与其他中药相反, 可协同并可显著增强已烯雌酚促细胞增殖的作用, 尤其在72h 时作用更为显著。
3. 3 10种中药植物雌激素受体调节剂作用比较
作用拟雌激素样
红花
+
结果显示:10种妇科常用中药的作用可以分为两类, 一类中药具有典型的雌激素受体调节剂特征:包括红花、川牛膝、丹参、淫羊藿、补骨脂、菟丝子等6种中药, 它们在单独用药, 即内源性雌激素水平较低时其含药血清可刺激MCF 27细胞增殖, 具有拟雌激素样作用; 在与雌激素同时用药, 即体内雌激素水平较高时又可表现出抗雌激素效应(表3, 4) 。另一类中药不符合雌激素受体调节剂特征:如枸杞主要在单独用药时表现出拟雌激素效应, 甘草主要在与雌激素同时用药时表现出抗雌激素效应; 而肉苁蓉在有或无雌激素存在时均表现出拟雌激素样作用; 女贞子则在单独用药时具有抗雌激素效应, 可在一定范围内抑制肿瘤细胞MCF 27。
+
表3 10种中药(单独用药) 川牛膝
+
丹参
+
女贞子
+
+
补骨脂
+
菟丝子
+
注:+-(与雌激素联合用药) 含药血清的雌激素拮抗作用
作用雌激素拮抗
红花
+
川牛膝
+
丹参
+
女贞子
-
枸杞
-
甘草
+
肉苁蓉
-
淫羊藿
+
补骨脂
+
菟丝子
+
注:+表示具有雌激素拮抗作用; -表示无雌激素拮抗作用
4 讨论
由于雌激素替代疗法在治疗妇科疾病, 如更年期综合征的同时, 可导致乳腺癌、子宫内膜癌等妇科肿瘤发生的危险性增加多地被植物雌激素代替
[2, 3]
, 所以近几年来已经更
[4]
。但进一步研究发现:植
物雌激素对乳腺癌的发生机会也将产生影响, 而且在不同条件下其结果不尽一致。例如当异黄酮作用
于ER (+) MCF 27细胞, 刺激和抑制其增殖均有报道
[5, 6]
。Ver ma 等证实姜黄素和金雀异黄素单独或
[7]
雌激素因可以与内源性雌激素竞争结合ER, 表现出
雌激素拮抗作用, 从而对激素相关性疾病具有保护作用。已有研究表明:异黄酮类植物雌激素可通过竞争结合ER 受体, 减弱雌激素诱导的乳腺癌细胞增生和
[12]
癌细胞的生成。本研究结果也显示:与己烯雌酚联合用药时, 多种中药含药血清对细胞增殖的促进作用显著低于阳性药对照组。研究发现, 植物雌激素发挥拮抗作用的机制较为复杂, 可能途径有:植物雌激素可以与雌二醇竞争子宫内II 型核雌激素受体位点, 通过调节细胞生长, 而发挥抗增殖和抗雌激素作用; 还可通过抑制促进癌细胞生长的酪氨酸激酶和雌激
[10, 13]
素合成酶的活性, 来减缓细胞的增殖。[参考文献]
[1] 贺红莉, 金 焕, 王继峰, 等. 雌激素受体调节剂及其相关中
联合应用可对抗环境雌激素诱导MCF 27的生长。
本实验室也发现, 一定浓度的金雀异黄素和大豆异黄酮可抑制E 2刺激引起的MCF 27细胞增殖, 减少ER 表达
[8, 9]
。本实验结果显示:红花、川牛膝、丹
参、枸杞、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂和菟丝子等中药含药血清均可表现出雌激素样作用。因中药植物雌激素与雌二醇结构的相似性, 所以它们可以与ER 相结合而发挥一定的雌激素效应。该作用与这些中药所含有的木脂素、香豆素、黄酮类成分有关子水提物无明显的雌激素样作用一致・438・
[11]
[10]
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[4] Yusuf Anand . Hor mone rep lace ment therapy:a ti m e for pause
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。而
女贞子组未见细胞增殖加速, 与有关文献报道女贞
。
另一方面, 当体内雌激素浓度较高时, 中药植物
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Eva lua ti on on phytoestrogen effects of ten k i n ds of Ch i n ese
m ed i c i n e i n clud i n g flos cartham i
ZHAO Pi 2wen, WANG Da 2wei, N I U J ian 2i L 2(B eijing U niversity of , )
[l ore of ten kinds of Chinese medicine including fl os cartha m i, radix cyathulae, radix ilti fructus ligustri lucidi, fructus lycii, radix clycyrrhizae, herba cistanches, herba ep i m edii, fruc 2tus p s oraleae and se men cuscutae . M ethod:240fe male Kun m ing m ice weighting 9~12g were random ly divided int o t w o main gr oup s A and B. A gr oup was divided int o 12s mall gr oup s:1s olvent contr ol gr oup, 1diethylstilbestr ol contr ol gr oup and 10Chinese medicine gr oup s . B gr oup was als o divided int o 12s mall gr oup s:1s olvent contr ol gr oup, 1diethylstilbestr ol contr ol gr oup and 10Chinese medi 2cine antagonistic gr oup s . M ice in ten antagonistic gr oup s were ad m inistered both Chinese medicine and diethylstilbestr ol everyday . Af 2ter ad m inistered (op ) f or 4days, bl ood was collected and seru m was separated . The effect of the phar macol ogical seru m on p r oliferati on rate of MCF 27(ER +) was analyzed by M TT 2assay . Result:I n A gr oup, p r oliferati on rates of MCF 27cells treated with seru m fr om eight Chinese medicine gr oup s including fl os cartha m i, radix cyathulae, radix salviae m ilti orrhizae, fructus lycii, herba cistanches, herba ep i m edii, fructus p s oraleae and se men cuscutae were coued markedly increase res pectively . W hile seru m fr om fructus ligustri lu 2cidi gr oup could markedly decrease the p r oliferati on rate of MCF 27cells . I n B gr oup, the increased p r oliferati on rate of MCF 27cells caused by diethylstilbestr ol was significantly reduced in seven Chinese medicine antagonistic gr oup s including fl os cartha m i, radix cya 2thulae, radix salviae m ilti orrhizae, radix clycyrrhizae, herba ep i m edii, fructus p s oraleae and se men cuscutae . W hile the increased p r o 2liferati on rate could be markedly enhanced in herba cistanches gr oup. Conclusi on:Six kinds of Chinese medicine such as fl os cartha 2m i, radix cyathulae, radix salviae m ilti orrhizae, herba ep i m edii, fructus p s oraleae and se men cuscutae show both estr ogenic effects (when adm inistered indepently ) and antiestr ogenic effects (when ad m inistered t ogether with diethylstilbestr ol ) . Such bidirecti onal effects depends on the internal estr ogen level .
[Key words] MTT 2assay; Chinese medicine; phyt oestr ogen; MCF 27cell
[责任编辑 古云侠]
《中国中药杂志》发表的论文“基于地理信息系统的苍术道地药材气候(作者:郭兰萍, 黄璐琦, 阎 生态特征研究”洪, 等) , 被评为“第四届中国科
协期刊优秀学术论文”。
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