生化实验一 总糖和还原糖含量的测定
实验一 总糖和还原糖含量的测定
（3,5－二硝基水杨酸法）
一、目的要求：
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。 二、实验原理:
在NaOH 存在的条件下，3,5－二硝基水杨酸（DNS ）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH 碱性溶液中此化合物呈棕红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色 桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
3,5－二硝基水杨酸（DNS ）试剂：称取6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml 容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml ，再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml 。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg ，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml ，即葡萄糖浓度为1.0mg/ml。
6mol/L HCl：取250ml 浓HCl （35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml 。
碘－碘化钾溶液：称取5g 碘，10g 碘化钾溶于100ml 蒸馏水中。 6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml 蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂。 2、材料
山芋淀粉 四、器材
723型分光光度计，分析天平，水浴锅，研钵，烧瓶，试管若干等。
五、操作
1、葡萄糖标准曲线制作
取干净试管6支，按表1进行操作。以吸光值为纵坐标，各标准溶液的浓度（mg ∕ml ）为横坐标作图得标准曲线。
管号
试剂
标准葡萄糖溶液∕ml
蒸馏水∕ml DNS 试剂∕ml
蒸馏水∕ml 葡萄糖含量∕mg
A 540nm
2、样品中还原糖的提取与测定
准确称取 0.5g 山芋淀粉，加蒸馏水约3ml ，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。于50℃ 恒温水浴中保温0.5h ，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到100ml 离心管中，于4000r ∕min 下离心5min ，沉淀用20ml 蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml ，混匀，作为还原糖待测液。取1ml 进行还原糖含量测定。 3、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g 山芋淀粉，加蒸馏水约3ml ，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml ，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h ，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I 2-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解完毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并用蒸馏水定容至100ml ，过滤，取滤液10ml 于100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液。取1ml 总糖水解液，测定其还原糖含量。
六、结果处理
1、各浓度标准葡萄糖溶液按表1进行反应后，溶液吸光值见表1。以吸光值为纵坐标，各标准溶液的浓度（mg ∕ml ）为横坐标作图得标准曲线。如图1所示。
0 0 1.0 2
1 0.2 0.8 2
2 0.4 0.6 2
3 0.6 0.4 2
4 0.8 0.2 2
5 1.0 0 2
沸水浴中准确煮沸5min ，取出，用自来水冷却至室温 9.0 0 0
9.0 0.2 0.051
9.0 0.4 0.110
9.0 0.6 0.150
9.0 0.8 0.205
9.0 1.0 0.253
图1 葡萄糖标准曲线
经分析得标准曲线回归方程为：y=0.2524x+0.0020，相关系数R 2=0.9984。
2、还原糖溶液按照表1进行反应后，测定得到溶液于540nm 处的吸光值为：A 1 将A 1代入回归方程得c 1
还原糖（mg ∕g ）= （c 1×100）∕m =
3、总糖溶液按照表1进行反应后，测定得到溶液于540nm 处的吸光值为：A 2 将A 2代入回归方程得c 2=
总糖（mg ∕g ）= （c 2×1000×0.9）∕m =
式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；
V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml ；
m──样品重量，g ；
0.9──乘以0.9是为了从测定的总糖水解成单糖量中扣除水解时所消耗的水量。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。
七、思考题
1. 简述3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的原理？
2. 本实验中盐酸、氢氧化钠和碘-碘化钾溶液的作用是什么？