大豆花叶病毒分子生物学研究进展1998

农业生物技术学报

JOURNAL OF AGRICULTURAL

BIOTECHNOLOGY

1998年 第3期 No.3　1998

科技期刊

大豆花叶病毒分子生物学研究进展

王升吉1　 吴元华2

(1 山东省农业科学院植保所，济南 250100；2 沈阳农业大学植物保护系，沈阳 110161)

摘　要：　大豆花叶病毒(SMV)基因组结构与其它马铃薯Y病毒组成员一样，是一条单链正意RNA，全长约10　000个核苷酸。整个基因组按一个阅读框架翻译，产生一个多聚蛋白前体，并通过蛋白酶切加工，形成不同功能的成熟蛋白：35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb、CP。基因组翻译产物的加工由三种病毒蛋白酶的参与，即：P1(35K)、HC和27K(NIa)。酶切加工产生的各种功能蛋白在病毒基因的复制、翻译、加工等整个生活史中发挥重要作用。

关键词：大豆花叶病毒； 多聚蛋白； 蛋白酶

大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一，是世界上广泛分布的一种病毒，我国该病毒发生普遍，引起大豆植株矮化、叶片皱缩、花叶、顶枯、种粒斑驳等症状，造成10%～30%的减产，严重影响大豆的产量、质量及出口创汇［1］。本文拟就SMV分子生物学的研究进展作一综述。

1　SMV基因组的结构和组成

1.1　SMV基因组的特点

关于SMV基因组的基本特点，最早报道于1980年(Hill)［2］。该病毒基因组是单链正意RNA，全长约10　000个核甘酸，5′端有一共价键连接的金属蛋白〔Vpg〕，3′端有一个Poly(A)尾巴，整个基因组按一个阅读框架进行翻译，产生一个大的多聚蛋白前体，并通过翻译时(后)的蛋白加工过程，切割形成不同功能的成熟蛋白［3］。与李痘病毒(plum poxvirus，PPV)、烟草脉斑驳病毒(tobacco vein mottle virus，TVMV)的多聚蛋白前体起始翻译在基因组的第二、三个AUG密码子不同的是，SMV基因组翻译成多聚蛋白起始于基因组的第一个AUG密码子，而终止密码子UAA在位点9330处。

1.2　SMV基因组结构

Ch.Jayaram等人(1992)［4］确定了大豆花叶病毒(SMV)G2、G7株系的基因组全长序列，与Potyvirus其它成员相似，其基因组全长序列为9　588　nt(3′端的Poly(A)序列除外)，经翻译产生的多聚蛋白前体为3　066个氨基酸。通过分析基因组翻译产物多聚蛋白裂解成的各个功能蛋白，推断出SMV基因组RNA的基因排列顺序，从5′-末端到3′-末端依次为：5′-NTR(non-translation region)、编码P1(35K)、HC(Helper component protease)、P3(42K)、CIP(Cylindrical Inclusion,CIP)、6K(功能未知)、Vpg(21K，Virial Protein Genomic-linked)、NIa(27K,Nuclear Inclusion a)、NIb(Nuclear Inclusion b)、CP(Coat Protein)的基因和3′-NTR(non-translation region)。

在基因组5′-NTR有一段前导序列，长度在85(PRSV)到205(TVMV)个核苷酸之间，这一序列有一共同特点，富含A而少G，在SMV中A近40%而G还不到1% 。5′端前导序列还有一个共同的保守序列，称为“Potybox”TCAACACAACAT。推测该保守序列在病毒生活史中起重要作用：如Vpg在5′端的结合过程，基因组RNA的翻译、复制等［5］。在3′-NTR，不同的Potyvirus成员之间在大小、序287列及预测的二级结构等都有很大的差异，而同种病毒的不同株系间其保守性却比外壳蛋白的还要强，常作为Potyvirus分子分类的依据。Brgan,G.T等人在Potyvirus的3′—NTR发现发卡状二级结构，在SMV中也发现这种类似结构5′GTGGTCTAACCAC3′，这种结构在负链RNA的复制起始中发挥作用［6］。关于SMV基因组各基因及编码蛋白大小见表1。

2.3　SMV基因组同源性

关于SMV各株系间，以及SMV与PVY组其它成员之间同源性问题，Ch.Jayarm做了研究，SMV的G2和G7之间核苷酸、氨基酸序列的同源性分别为94%和97%，其中明显的变异主要发生在基因组5′端区域，G2与Potyvirus其它成员的氨基酸序列同源性也作了比较(表2)。从表中可看出，在Potyvirus 5个成员中5′端的35K(P1)、42K(P3)的同源性最差，最保守的区域为CI蛋白、NIb蛋白和外壳蛋白。从NIb、CIP和21K蛋白看，SMV与PPV同源性最高，而SMV CP与PVY和TEV CP同源程度最高。综合结果，SMV与PPV同源性最高。

表1　SMV基因组基因核苷酸数及其编码蛋白氨基酸数

Table 1　The nucleotides of the SMV Genomic genes and the amino acids of proteins encoded by virus genes

基因

Gene 5′-NTR 35K HC 42K CIP 6K Vpg NIa NIb CP 3′-NTR 合计

Total

核苷酸数

nt 131 924 1371 1197 1903 161 567 729 1551 795 259 9588

编码蛋白氨基酸数

aa. NA 308 　457 399 634 　54 189 243 　517 265 NA 3066

注：NA表示不编码 表2　SMV G7株系与potyvirus其它成员(包括SMV G2株系)基因组编码功

能蛋白氨基酸序列同源性比较(%)

Table 2　Percentage amino acid sequence identity of predicted mature proteins of SMV

strain G7 with those of other potyviruses including SMV strain G2(Jayaram,1992)

Virus SMVG7

35K HC 42K CIP 6K 21K 27K Nib CP

G2 94 98 94 96 100 99 99 98 99

PPV 14 44 29 72 32 53 48 60 51

TVMV 6 45 13 51 32 45 47 54 52

PVY 13 37 17 52 32 45 35 56 64

TEV 9 43 25 51 45 46 34 55 60

2　基因组翻译产物的加工和功能

2.1　基因组翻译产物的加工

Vanoe,V.B等(1984)认为，SMV基因组RNA产生的多聚蛋白前体也有类似其它马铃薯Y病毒成员的蛋白加工过程［3］。即通过翻译时或翻译后的蛋白酶解加工过程，将多聚蛋白前体酶解为9个结构基因产物(功能蛋白)：35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb、CP(图1)。SMV的基因组多聚蛋白的酶解加工过程由3种病毒蛋白酶的参与，即：P1 (35K)、HC和NIa蛋白酶。其酶解加工过程可参考TEV的(图2)，三种蛋白酶的功能见后面基因产物的功能部分。

2.2　SMV基因产物的功能

对SMV基因产物，研究最多的是外壳蛋白(CP)，其次是NIb和NIa，其它基因产物的功能知之甚少，在此根据Potyvirus其它成员的比较得到了一些推测性结论。

(1)5′末端蛋白：35K(P1)、HC、42K(P3)， 这几个蛋白的功能，在SMV上研究尚少。35K、HC蛋白在基因组翻译产物加工中发挥重要作用，Carringtion等(1989)证实［7,8］，在SMV多聚蛋白前体5′-末端的P1 (35K)和HC之间、HC和42K(P3)之间的酶切位点，分别由这二种蛋白酶识别切割，分别将其自身从多聚蛋白前体切割下来。切割的双肽序列分别为(Y/F)′S、G′G(“′”表示酶切点，下同)(图1)。Domier等(1987)［9］研究TVMV的P1蛋白认为其与病毒粒子在寄主细胞之间的转运有关。由于35K(P1)、42K(P3)蛋白在Potyvirus中同源性很低，而同种病毒的不同株系间，具有94%同源性，所以比较该二种蛋白，也可作为Potyvirus分类的依据。他还认为这三个蛋白还可能与寄主的抗性有关。HC蛋白与蚜虫的传播有关。

图1　SMV多聚蛋白上氨基酸酶解位点及酶解后产生的各成熟蛋白

Fig.1　Cleavage site and predicated mature proteins of SMV polyprotein

酶切位点处双肽序列及其基因组编码位置分别标于框的上方和下方 The dipeptide which cleavage occurs and their position in the genome are shown above and below the map，respectively YS:35K蛋白酶酶切位点the cleavage site of 35K protease; GG:HC蛋白酶酶切位点 the cleavage site of HC protease;QS、QS、QS、ES、QG、QS——均为NIa蛋白酶酶切位点。其中“ES”为NIa蛋白酶的一个次级酶切位点 All are cleavaged by NIa protease.Among them,“ES”is a late event cleavage site of NIa protease

图2　TEV基因组结构和多聚蛋白前体酶解加工模式

Fig.2　Genomic map of TEV and model for protease processing of

its precursor polyprotein Maria A等,1992 Maria A.et al,1992

P3(42K)蛋白在Potyvirus成员之间的同源性最差，仅为25.7%～33.0%［10］，它是否是翻译产物加工的辅助因子，还是RNA复制过程中的辅助因子，或在翻译、复制中起调控作用，尚无任何证［11］。

(2)CIP：即风轮状内含体蛋白，电镜观察，所有马铃薯Y病毒组的病毒都能在寄主细胞中形成风轮状内含体，这与CIP的作用有关［12］。它所形成的内含体同原生质膜、胞间连丝及内质网联系在一起，也说明CIP起结构性功能，它可能改变细胞骨架适应病毒的合成和转运。SMV CIP由一组具解旋酶特性的蛋白质组成保守的核苷酸结合保守区，简称NTBM，参与病毒RNA的复制，CIP有核酸刺激的ATP酶活性，并能解开RNA螺旋，这个解旋酶活性是由3′→5′方向的［13］。RNA解旋可能是基因组复制的早期步骤，对CIP研究有助于了解RNA复制机理。

(3)6 kD蛋白：功能目前尚不太清楚，推测可能与复制有关，它可能把NIa/Vpg定置在膜上，阻止NIa蛋白核定位功能，干扰NIa的向核转移活性。只有通过NIa自身的自我酶切活性使NIa与6KD分开，才能使NIa恢复向核转移定位的能力。

(4)NIa蛋白：由21K(Vpg)蛋白和27K(NIa)蛋白酶两个域组成，其N端是21K(Vpg)蛋白，其保守序列中富含芳香族氨基酸，如Tyr，Phe，并通过Tyr等残基与基因组RNA连接，推测行使RNA复制起始或参与RNA中间体的加工的功能。NIa蛋白的C端是27K(NIa)蛋白酶，27K(NIa)蛋白酶是含有丝氨酸(Ser)的胰蛋白酶，其活性由His、Asp、Cys组成的三分体决定。在SMV中His、Asp和Cys分别在236、271和341位置。27K(NIa)蛋白酶N端的3/4区域，同源性很高，该保守区氨基酸可能导致蛋白的适当折叠，以使构成催化活性部位的重要氨基酸残基(His、Asp、Gys)形成特定结构域。27K(NIa)蛋白酶的C端氨基酸序列在不同Potyvirus成员之间，同源性差别很大，而SMV不同株系之间如(G2、G6、G7株系)同源性很高，这可能与27K(NIa)蛋白酶切位点的高度专一有关，使得具有相同酶切位点的各个potyvirus成员的27K(NIa)蛋白酶识别自身单一的酶切序列。27K(NIa)蛋白的胰蛋白酶活性的重要作用是对基因组的翻译产物起加工作用。Ghabrial等(1990)［14］从SMV G6株系上的研究认为，27K(NIa)蛋白酶的酶切位点在多聚蛋白上氨基酸序列为Q′S或Q′G的双肽之间(图1)。进一步对切点旁侧氨基酸序列进行分析，得SMV NIa蛋白酶识别位点的七肽保守序列为：

P6　　　　 P5 　　　P4 　　　P3 　　　P2 　　　P1′ 　　　P1

Asn/Glu Xaa Val Xaa Xaa Glu Gly/ser

27K(NIa)蛋白的加工切割只同剪切点周围的七肽保守序列有关，而与剪切点周围的其它氨基酸无关，其对基因组翻译产物的加工作用主要是酶切包括它自己在内的五至六个保守切割点，涉及到整个多聚蛋白近C端2/3的区域［16］。图1中42K/CI、CI/6K、6K/21K、27K/NIb、NIb/CP5个切点(QS、QS、QS、QG、QS)均由NIa蛋白酶识别切割。其中21K/27K之间的ES切割点是一个次级酶切位点，由NIa蛋白酶切割NIa蛋白内部产生基因组连接蛋白21K(Vpg)和27K(NIa蛋白酶)。这个酶切位点的七肽保守序列(E/Q)(D/E/R)(L/V)XXE′(G/S/A)(E/K)(S/A)(L/V)与其它已知Potyvirus成员相一致。

(5)NIb蛋白：一般被认为是一种依赖于RNA的RNA聚合酶［16］。刘俊君等(1994)［17］SMV NIb序列与WMV-Ⅱ NIb等其它Potyvirus成员比较发现从N端到C端含有5段高度保守多肽序列，其中序列GNNSGQPSTVVDNT(S)LMVXXA和GDD是所有动物、植物以及细菌病毒依赖于RNA的RNA聚合酶的两段特征性保守序列。类比性研究发现，GDD保守区在结构上类似于ATP和GTP结合酶类的B保守区NTP结合位点，而GNNSGQPSTVVDNT类似于ATP和GTP结合酶类的A保守区，推测这二个保守区可能直接参与了酶促反应中与底物结合的过程，是RNA复制酶活性中心和维持核酸结构不可缺少的区域［18,19］。

(6)CP蛋白：目前对于马铃薯Y病毒组成员的CP蛋白(Coat protein)的结构和功能研究得最深刻。其最基本的功能是作为结构蛋白包被RNA。SMV CP是由265个氨基酸组成的多肽，分子量为30 kD，由单一多肽链构成［4］。所有potyvirus成员CP从空间结构上看，CP的单一肽链折叠成三个球状的结构域：N端、C端和抗胰蛋白酶的核心区［20］。大量证据表明，CP的N端和C端暴露在粒体表面，用胰蛋白酶温和处理，可以水解CP的N端30个及C端约18～20个氨基酸的肽段［21,22］。留下的核心仍形态完整。每个CP这样的空间结作为一个亚基，由大约2 000个CP亚基包括病毒基因组RNA，装配成一个病毒粒体［20］。Ward等(1991)认为CP亚基暴露的N端区域有很大的差异，说明它参与了病毒特异的作用或寄主，介体，病毒的相互作用［23］。CP编码有寄主决定因素，主要涉及寄主，介体、病毒的相互作用，例如可以影响寄主范围和症状诱导［22］。在蚜传的病毒CP蛋白N端存在一个特殊保守的(I/V)DAG块［24,25］，Atreya等(1990)用全长TVMV cDNA克隆单一改变VDAG为VDAE产生了一个非蚜传株，已经发表的SMV-N(非蚜传株系)的CP缺少DAG序列。说明DAG块和N端其它氨基酸对蚜传有相关性［26］。现将SMV基因产物的功能列表(见表3)。

表3　SMV基因产物功能

Table 3　Functions of SMV gene products

基因产物

Gene products 氨基酸序列特征

Character of amino acid sequence 功能

Function

35K(P1)P 丝氨酸型蛋白酶? 蛋白酶解，细胞间运动、寄主抗性

HC-Pro 半胱氨酸型蛋白酶? 蛋白酶解、蚜传、寄主抗性

42K(P3) 　 翻译产物加工?(辅助因子)

ⅡCI 具保守序列GAVGSGKST，为核苷酸结合保守区复制(解旋)，细胞间运动?

6K 　 复制?阻止NIa核定位

21K(Vpg) 富含芳香族氨基酸 复制起始等

NIa 丝氨酸型蛋白酶，由His、Asp、Cys构成催化活性区域 蛋白酶解多聚蛋白近C端的五至六个保守切割点

NIb 含依赖于RNA的RNA复制酶的保守区域，如(GDD)等 复制、促进酶与底物的结合等

CP 单一肽链折叠成三个球状结构域,N端,C端,核心区,蚜传株系有DAG块 蚜传，RNA包装、寄主范围，症状诱导

3　关于SMV分子生物学研究中的一些问题

我们知道，SMV只侵染5个科的植物，寄主范围非常窄，而西瓜花叶病毒(WMV-Ⅱ)可侵染22个科的植物，寄主范围较宽，即二种病毒寄主范围不同，很难断定他们是一种病毒或近缘的。可是，根据CP基因、NIb基因、3′-NTR区域的核苷酸序列比较，得出完全相反的结论。刘俊君根据RdRp很可能是生命起源过程中最早形成的酶类之一的观点，认为NIb可能是病毒分子分类学的最好尺度。在potyvirus不同成员之间，NIb蛋白具有相对保守性，不同成员之间氨基酸同源性在52.7%～60.9%，同种病毒不同株系之间核苷酸同源性为82.7%～83.1%，氨基酸同源性94.6%～95.6%。SMV-BJ和WMV-Ⅱ(USA)NIb的氨基酸比较；同源性可达91.3%，核苷酸同源性80.3%，远远高于不同成员之间的同源性，所以综合比较SMV-BJ的3′-NTR区域，CP基因，和NIb基因与WMV-Ⅱ之间的同源性，认为WMV-Ⅱ是SMV的一个西瓜株系。更精确的分类关系有待于两种病毒的生物学和分子生物学的进一步研究结果。

王升吉:男，35岁，硕士研究生，助理研究员

王升吉等： 大豆花叶病毒分子生物学研究进展

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收稿日期：1997-10-30　第 3 期

Advances of Research on Molecular Biology of

Soybean Mosaic Virus

Wang Shengji1　 Wu Yuanhua2

(1 Institute of Plant Protection,Shandong Acad of Agric Sci,Jinan 250100;

2 Department of Plant Protection,Shenyang Agric Univ , Shenyang 110161)

Abstract:　The soybean mosaic virus(SMV)has a genome consisting of a single-stranded positive-sense RNA,similar to those of other potyvirus.It is composed of approximately 10　000 nucleotides long with a coding capacity for a precursor polyprotein.By the processing of protease cleavage,nine mature proteins are formed:35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb and CP.Three virus-encoded protease participate in the processing of precursor polyprotein,they are 35K(P1)、HC and NIa protease.All mature protein generated from protease processing have important functions in the whole viral living cycle,including that polymerase、translation、and processing,etc.

Key words:　soybean mosaic virus; polyprotein; protease