银杏叶黄酮提取及含量测定

银杏叶黄酮提取及含量测定

一、实验目的

1、掌握银杏叶中黄酮的提取方法

2、了解银杏叶中黄酮的含量测定

二、实验原理

近几年来，随着对黄酮类化合物研究的日益深入与重视，黄酮类化合物提取技术的发展也得到了促进。目前提取黄酮类化合物的方法主要包括有机溶剂浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法、微波提取法和酶提取法等。 １．１ 有机溶剂浸提法

目前国内外使用最广泛的银杏叶中黄酮的提取方法就是有机溶剂提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些极性较大的混合溶剂，如甲醇－水（１＋１）溶液。由于甲醇的毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为提取剂。银杏叶干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、提取、过滤，滤液中的溶剂经减压蒸馏除去后得银杏叶浸膏粗提物。徐桂花等［１］提取银杏叶中黄酮类化合物时，采用乙醇（７０＋３０）溶液为提取剂，提取温度为７０℃，料液质量浓度比为１ｇ比４０ｍＬ，提取时间为４ｈ。由于乙醇提取工艺在安全性、溶剂成本、效率及杂质酚酸去除等方面都不能应对日益严酷的市场竞争，张林涛等［1］提出了以硼砂－ 氢氧化钙碱水为溶剂提取银杏叶黄酮，其黄酮提取率与文献值相近，但提取工艺时间缩短为１ｈ。

１．２ 超声波提取法

超声波提取法是利用搅拌作用、强烈的振动和空间效应、高的加速度等使药物有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并能消除高温对提取成分影响的一种提取法。刘晶芝等［2］运用了超声波技术与水浸提取相结合的方法得出超声波提取的最佳工艺条件为：超声频率４０ｋＨｚ，超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比１００，提取温度３５℃，静置３ｈ，提取率为８１．９％。郭国瑞等［3］以水为介质，超声波提取银杏叶中黄酮苷，与常规水浸提法比较，超声波提取效率大大提高，确定超声波提取的最佳工艺为：超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比３０，提取温度５０℃，提取率为８２．３％。 １．３ 超临界流体萃取法

超临界流体萃取法是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对有效成分进行萃取和分离的新技术。可作为超临界流体的物质很多，其中二氧化碳临界温度（ＴＣ＝３１．３℃）接近室温，且具有无色、无毒、无味、不易燃、化学惰性、价廉、易制成高纯气体等优点而被广泛应用，特别在中药材及其制剂中更显示出其独特、简便、快速、具有较高的选择性、提取杂质少、可直接进样分析的优点。邓启焕等［4］探讨了超临界萃取银杏叶有效成分的影响因素，最佳条件为萃取压力２０ＭＰａ、时间９０ｍｉｎ、粒度３．９ｍｍ、温度４０℃，经测定银杏叶黄酮的质量分数为２８％，高于国际公认标准。

１．４ 微波提取法

微波提取法是利用分子或离子在微波场中的导电效应直接对物质进行加热从而提取植物细胞内耐热物质的新工艺。曾里等［5］的研究表明以乙醇溶液作溶剂比以水作溶剂的效果好，最佳条件为以乙醇

（６０＋４０）溶液为提取剂，解冻处理２０ｍｉｎ。张鹏等［6］对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行了研究，最佳提取条件为以乙醇（５０＋５０）溶液

为提取剂，料液比为１ｇ比２５ｍＬ，回流温度７０℃，微波时间１２０ｓ，该条件下总黄酮提取率为１１．０２％。但微波提取存在局限性，它要求被处理的物料具有良好的吸水性而且只适用于生物细胞内耐热物质的分离提取，否则细胞难以吸收足够的微波将自身击破，产物也难以迅速释放出来。

１．５ 酶提取法

酶提取法是利用酶反应的高度专一性，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁，从而提高有效成分的提取率。在银杏叶总黄酮提取过程中，由于细胞壁的束缚作用，总黄酮不易溶出。酶提取法能将组成细胞壁的纤维素骨架逐级降解成葡萄糖，进而破坏细胞壁骨架结构，增加细胞内有效成分的溶出。吴梅林等［7－１０］采用纤维素酶对银杏中黄酮类化合物进行了提取，三者的酶解条件分别为酶质量浓度０．４０ｇ·Ｌ－１，酶作用时间１２０ｍｉｎ，酶解温度５０℃，酶解介质ｐＨ ４．５，乙醇（７＋３）溶液，提取温度７０℃；纤维素酶浓度４０Ｕ／ｍＬ，酶解ｐＨ ４．８，酶解温度５５ ℃，酶解时间９０ ｍｉｎ；维素酶用量３０ＦＰＩＵ／ｇ银杏叶、酶解时间５０ｍｉｎ。此外，许明淑等［１１］利用Ｓｕｈｏｎｇ ＧＡ ４７５转苷酶和麦芽糖基供体将极性低的黄酮苷元转为黄酮苷，提高了总黄酮在醇水中的溶解率。结果表明：温度为５５℃～６０℃，ｐＨ 为６．０～６．５，反应时间为１０ｈ时，总黄酮的提取率比未加酶对照组增加了４４％。王建伟等［１２］采用复合酶对银杏叶进行初步的预处理，然后用转化酶将黄酮苷转化为生物活性较强的苷元类物质，银杏提取物（含银杏黄酮醇苷不小于２４％）经过生物转化后各苷元的质量分数为：槲皮素占２４．８７％，山奈酚占３０．１８％，异鼠李素占４．６０％，总苷元质量分数为５９．６５％，显著提高了银杏叶提取物（ＧＢＥ）的生理活性和苷元黄酮的含量，从而大大提高了银杏黄酮的生物学效价。

本实验中提取采用第一种方法——溶剂提取法。

对银杏中黄酮的总含量测定的方法较多, 但对采用微波干燥方式对叶片进行干燥的报道较少。本文运用U V 法测定银杏叶及树皮中黄酮含量。

三、器材与试剂

1、器材：银杏叶、索氏提取装置、紫外分光光度仪、电炉、烘箱、10ml容量瓶、50ml容量瓶、试管、胶头滴管、玻璃棒、温度计、圆底烧瓶、石棉网。研钵、烘箱

2、试剂：芦丁标准液、甲醇、30%乙醇、NaNO2、A1(NO3)3、NaOH、糖类（葡萄精、D～果糖、蔗糖，乳糖和麦芽糖）、氯仿等

四、实验步骤

(一)黄酮类化合物的提取：准确称量1．5g左右银杏叶，于索氏抽提器中用甲醇提取曲，浓缩并转入50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀后取1 ml， 于10mI容量瓶中用30 乙醇一水稀释至刻度，供分析用

(二)分光光度法测定总黄酮含量： 以芦丁为标样测定银杏叶中总黄酮的步骤如下。将一定量样品液置10mI容量瓶中， 用30% 乙醇补充至5 m1， 加入0．3mI NaNO2(1：20)，摇匀，放置5min后加入0．3m1 A1(NO3)3(1：10)， 6min后再加入2ml 1mol／LNaOH，混匀，用30% 乙醇稀释至刻度，lOmin后于波长51Oam处进行比色测定，试剂为空白参比。有关条件试验结果：

1．比色溶液显色后，在4h内吸光度的变化

2 .加入的NaNO2、Al(NO3)3和NaOH的量分别在0．1～0．4mi，0．1～O．4ml和O．5～

4ml溅定的吸光度基本不变。

3．加入20倍于芦丁含量的下列之的糖类；葡萄精、D～果糖、蔗糖，乳糖和麦芽糖，不干扰黄酮的比色测定。

4．提取液中含有的叶绿素等杂质的影响：将银杏叶提取液浓缩， 以热水溶解后，用氯仿脱脂2次，除去叶绿素等溶于氯仿的成分，测得总黄酮含量平均低11 (部分I游离的黄酮甙元溶于氯仿)，叶绿索等杂质对总黄酮测定影响不会超过11 。

5．标准曲线： 以O．091mg／ml的芦丁标准液进行比色测定，用最小二乘法作线性回归，得方程丫=0．8965X一0．001403，r=0·99989。

6．方法的回收率和精密度；用标准加入法测定了样品提取和比色测定流程的回收率，结果表明：银杏叶用甲醇一索氏法提取有效成分，稀释后直接比色测定，黄酮甙能定量回收。变异系数为1.6% (n=4)。

五、结果与讨论

1、不同时期的银杏叶中黄酮含量是否一致？

2、本实验中溶剂提取法有什么优点和缺点？

3、简述实验中要注意哪些事项。

参考文献：

［1］ 张林涛，张锋，王志样，等．中国药物警戒［Ｊ］，２０１１，８

（3）：１４７－１５１．

［2］ 刘晶芝．安徽农业科学［Ｊ］，２００７，３５（１４）：４１０５－４１０６． ［3］ 郭国瑞，谢永荣，钟海山．赣南师范学院学报［Ｊ］，２００１

（３）：４５－４８．

［4］ 邓启焕，高勇．中草药［Ｊ］，１９９９，３０（６）：４１９－４２２． ［5］ 曾里，刘世贵．四川大学学报［Ｊ］，２００４，４１（４）：８３３－ ８３６．

［6］ 张鹏．安徽农业科学［Ｊ］，２００９，３７（１２）：５４９６－５４９７． ［7］ 吴梅林，周春山，陈龙胜，等．天然产物研究与开发［Ｊ］，