选修实验:细菌培养技术

实验三：学习细菌培养的基本技术

实验原理：①要根据微生物的营养需要，采用相应的配方配制培养基。

②培养基除满足微生物所需各种营养外，还要适宜的pH 值。本实验所用的牛肉膏蛋白胨培养基应用广泛，适于多种细菌的培养。

④配置好的培养基必须经过灭菌，一般采用高压蒸汽灭菌。在整个细菌接种培养过程中，一般要求无菌操作。

方法步骤：

一、培养基的配制 称量 → 溶化 → 调pH 值 → 培养基的分装 →

加水加热 边滴边搅拌 趁热分装 棉塞长度2/3在内 外加牛皮纸

随时用测pH 值 培养基高度为1/5 挂上标签

二、灭菌 高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。

灭菌原理:依据高压升温使菌体细胞蛋白质凝固变性失去生命力, 将0.11MPa 、121o C, 维持30min 彻底灭菌 操作：加水、装料 → 加热、排气 → 升压、保压 → 降压、排气

加开水适当, 试管 打开排气阀, 加热至沸腾 压力至0.11MPa,T 为121o C 压力降至0,

口向上, 不能太挤 排气5～10min, 关闭 控制热源，保压30min T

三、搁置斜面

当T 接近50o C ，将试管摆在一根木棒上。培养基形成的斜面不超过试管总长度的一半。

四、接种 微生物接种的各项操作要求必须在无菌条件下进行。

①设备的准备和消毒： 设备：无菌操作箱(无条件可直接在在酒精灯上) ，接种环

双手 75％酒精消毒 熏蒸法或紫外灯灭菌 灼烧法消毒

②采菌：点燃酒精灯→用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管→靠近酒精灯火焰, 旋松棉塞→右手拿接种环, 在火焰上烧红灭菌→取下棉塞，并灼烧试管口一周→接种环伸入试管，挑去少量菌体，立即抽出 ③接种：迅速将接种环插入培养试管中→在斜面上由管底向管口连续轻划几道蛇形曲线

（画线要求：线要划密一些, 不要划破培养基, 不要使接种环接触到管壁或管口, 不重复划）

→及时抽出接种环→将试管口在火焰上灼烧，塞上棉塞→熄灭酒精灯, 菌种加热倒掉

五、保温培养 接种后，试管放在保温箱中，25o C 下培养5～7天(37o C 下培养24h)

练习：

一、选择题

1、下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ）

A 、防止杂菌污染 B 、消灭杂菌 C 、培养基和发酵设备都必须灭菌 D 、灭菌必须在接种前

2、制作细菌培养基时，pH 值应调为（ ）

A 、4.5～6 B 、7.4～7.6 C 、7.8～8 D 、2～4

3、下面的资料表明在各种培养基中细菌的生长（S 、C 、M 为简单培养基，U 、V 、X 、Y 、Z 代表加入培养基的不同物质），问哪一些物质细菌不能合成（ ）

A 、U B 、V C 、Y D 、Z

4、细菌培养基常在121o C压力锅中灭菌，如果只是在100o C 的温度下降细菌培养基灭菌，以下哪一种生物仍会存活（ ）

A 、大肠杆菌 B 、一种青霉 C 、枯草芽孢杆菌 D 、沙门氏菌

5、下列操作与灭菌无关的是（ ）

A 、接种前用火焰灼烧接种环 B 、接种前用酒精擦拭双手

C 、培养基在50o C 时搁置斜面 D 、接种在酒精灯的火焰旁完成

6、培养基分装完毕以后，在管口上加一棉塞，下图中哪种加棉塞的操作是正确的（ ）

7、在用高压蒸汽锅灭菌时，其灭菌的正常压力为（ ）

A 、49KPa B 、98KPa C 、9800KPa D 、9.8KPa

8、高温灭菌的原理是（ ）

A 、每种微生物生长的最适温度是一定的

B 、微生物对于高温环境部适应

C 、高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动

D 、高温降低了环境中氧的浓度

9、在培养基的配制过程中，下列哪项操作是不正确的（ ）

A 、趁热降培养基分装到洁净的试管中，培养基高度为试管长度的1/5

B 、在溶化过程的最后要补加蒸馏水至100mL

C 、在调pH 值时要随时用pH 试纸测pH

D 、试管加塞后，每10支用绳扎捆，在试管外挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名，就

可以进行灭菌

10、在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序是（ ）

①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上成水平状态②右手拧送棉塞，但不取下

③在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞，将它们取下，同时左腕转动，烧灼管口一周。

④将接种环伸入管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少量菌体，立即将

接种环抽出。

⑤右手拿接种环，在火焰上灼烧灭菌。

⑥在火焰旁迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部，由里向外轻轻画蛇形细线。

⑦抽出接种环，再用火焰烧灼管口，并在火焰上方将棉塞塞上。

A 、①②③④⑤⑥⑦ B 、①②⑤③④⑥⑦ C 、①③②④⑤⑥⑦ D 、②③①④⑤⑥⑦

11、下列有关碳源的叙述不正确的是（ ）

A 、 碳源主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物

B 、某些碳源可以作为微生物的主要能源物质

C 、蛋白质一定不能做碳源

D 、不同种类的微生物的碳源可能不同

12、细菌数目上升的最快时期和活菌数目的高峰期分别是（ ）

A 、对数期、稳定期 B 、稳定期、稳定期 C 、对数期、对数期 D 、稳定期、对数期

13、菌种鉴定的重要依据是（ ）

A 、细菌的大小、性状颜色 B 、菌落的大小、形状、颜色 C 、有无鞭毛 D 、培养基的不同

二、简答题

1、为使培养基呈固体状态，需要配置好的各营养液成分的液体里加入 ，溶化冷却即可。调节培养基的pH 值，用浓度为1mol/L的 或 溶液进行调节。

2、搁置斜面时培养基温度不能 ，否则培养基会变成 。应趁热将试管放置成斜面形，使管内培养基形成斜面的长度不超过试管总长的 。

3、微生物接种时各项操作必须在 条件下进行。因此必须在 中操作。接种环要在 上用灼烧法灭菌，双手用 ％的酒精消毒。接种时将灭菌的接种环挑去一点 ，迅速插入培养基试管里，在斜面上由 向 连续划几道 线，然后将试管口在火焰上灼烧，塞上 。接种后的试管要放入 箱中在 下培养，即可见斜面上出现 。

4、关于水污染对生物的影响的实验如右图所示，将放置一天的洗碗水、河水、自来水各5mL ，分别注入1～3号试管中。再各滴加几滴0.01%亚甲基蓝溶液。把上述试管在温暖环境中放置40min 后，1号试管内水样由蓝色变为无色，2号试管内水样变为浅蓝色，3号试管内水样的颜

色无变化。请回答：

（1）在1号、2号试管内水样中大量繁殖的生物是 。

（2）上述生物的数量与水样中的 含量成正比。

（3）1号、2号试管内水样变色的原因是

。

5、以下是一个证明食物腐败是由细菌引起的实验，阅读材料和图示，回答相关的问题。

①把碎肉或大豆加水煮烂，用两次纱布滤取肉（豆）汤备用。

②在3只三角烧瓶里各注入50mL 肉（豆）汤。第1个瓶不

同瓶塞，第2个瓶用药棉塞紧，第3个瓶用紧有S 形弯玻

管的药棉塞塞住（如下图）。

③把3只烧瓶放入盛水的锅子里隔水加热，使锅子里的水沸

腾5min 。取出3只三角烧瓶，冷却后放在温暖的阴暗处（日

平均温度在20C 以上）

④以后，逐天观察肉（豆）汤的变化。结果，一天后，不加

塞烧瓶里的肉汤已浑浊，液面有一层薄膜，这是细菌的群体，叫做菌落。瓶内可以有臭味，说明肉汤已腐败。加药棉瓶塞烧瓶的肉汤几天后也开始腐败。加药棉塞和S 型玻管的烧瓶维持时间最长，但肉汤也将终将腐败。

（1）本实验采用的是什么实验法？

（2）不加塞的瓶内肉汤为什么会腐败？

（3）加药棉瓶塞烧瓶内的肉汤几天为什么也开始腐败？

（4）实验操作的第③步是起 作用。

o

答案：

一、选择题

1、B 2、B 3、C 4、C 5、C 6、A 7、D

8、B 9、B 10、C 11、C 12、A 13、B

二、简答题

1、琼脂 NaOH HCl

2、太低 固定 1/2

3、无菌 无菌箱 酒精灯 75 菌落 管底 管口 曲

棉塞 恒温 25 5－7 菌落

4、（1）好氧细菌 （2）有机物 （3）好氧细菌氧化分解亚甲基蓝染料

5、（1）对比实验法

（2）不加瓶塞的烧瓶直接接触空气，腐败细菌进入机会最多。肉汤有多种养分，在适宜的温度下，细菌迅速繁殖，使汤液中有有机物腐败分解

（3）加有棉塞的烧瓶，细菌进入机会较少，但也很难防止细菌侵入，同时由于消毒不彻底，留在瓶内的细菌芽孢可能发芽繁殖

（4）灭菌